段元慧朱曉鳴韓 冬楊云霞金俊琰解綬啟

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

異育銀鯽幼魚對(duì)飼料中維生素K需求的研究

段元慧1,2朱曉鳴1韓 冬1楊云霞1金俊琰1解綬啟1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

以不同維生素K水平(0.13、2.15、3.25、6.40、12、17.20和23.20 mg/kg飼料)的7種精制飼料喂養(yǎng)初始體重約為(2.17±0.01) g的異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)10周, 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù), 研究異育銀鯽對(duì)維生素K的需求量。結(jié)果顯示: 飼料中維生素K的添加可以明顯降低攝食率, 飼料中維生素K含量為2.15 mg/kg時(shí), 攝食率出現(xiàn)最大值, 之后顯著下降(P<0.05), 在12 mg/kg時(shí)達(dá)到最低值。特定生長(zhǎng)率隨著維生素K的添加表現(xiàn)出升高的趨勢(shì), 飼料中維生素K含量為12 mg/kg時(shí), 出現(xiàn)最大值, 但是差異不顯著(P>0.05)。飼料中維生素K的含量從0.13 mg/kg升至3.25 mg/kg時(shí), 飼料效率顯著升高(P<0.05), 隨著飼料中維生素K的進(jìn)一步添加, 趨于穩(wěn)定(P>0.05), 在12 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值, 并且與特定生長(zhǎng)率呈正相關(guān)關(guān)系(SGR = 0.01 FE + 0.95, R2= 0.95)。血液紅細(xì)胞數(shù)目隨著飼料維生素K含量的增加先顯著升高(P<0.05), 在6.40 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值, 之后趨于穩(wěn)定(P>0.05)。血紅蛋白含量、血球容積比、血清鈣含量與血液中紅細(xì)胞數(shù)目表現(xiàn)出相似的趨勢(shì), 均在不添加維生素K組出現(xiàn)最低值, 但是差異不顯著(P>0.05)。肝體比、肥滿度及魚體生化組成均不受飼料維生素K水平的影響(P>0.05)。分別對(duì)飼料效率、紅細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行折線回歸得出異育銀鯽幼魚對(duì)維生素K的最適需求量為3.73—6.72 mg/kg飼料。

異育銀鯽; 維生素K; 飼料利用; 血液指標(biāo); 需求量

維生素K是脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)最晚的脂溶性維生素, 但是它的代謝作用卻是闡釋最清楚的[1—3]。維生素K在體內(nèi)最主要的功能是配合其他特定蛋白質(zhì)形成凝血酶原、凝血因子Ⅸ、Ⅶ、Ⅹ及維生素K依賴性蛋白質(zhì)C、S, 進(jìn)而幫助血漿中血塊的形成, 因此又被稱為凝血維生素。維生素K為谷氨酸γ-羧基化酶系統(tǒng)中的必需因子, 參與維持鈣平衡和細(xì)胞膜的完整性, 此外, 維生素K還在鈣的動(dòng)員和骨骼生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。其他有關(guān)維生素K的生理功能尚不清楚。維生素K在體內(nèi)有三種活性形式, 分別是葉綠醌(phylloquinone, PK)、維生素K2和維生素K3[3]。其中, PK主要由綠色植物和藻類合成, 維生素K2主要通過微生物的合成, 動(dòng)物飼料中最常應(yīng)用的是人工合成的維生素K的鹽, 為亞硫酸氫鈉甲萘醌(Menadione sodium bisulfite, MSB)。MSB在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)化成其活性形式4-甲基萘醌(Menaquinone-4, MK-4)[3—5]。

在水產(chǎn)動(dòng)物中, 研究主要集中在維生素K在體內(nèi)發(fā)揮的生理功能和對(duì)它的需求上。維生素K缺乏會(huì)導(dǎo)致魚類出血、貧血、血球容積比降低和凝血時(shí)間延長(zhǎng)等癥狀[6—8]。在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究中發(fā)現(xiàn)維生素K缺乏會(huì)導(dǎo)致低肝體比及貧血現(xiàn)象[9]。鮭魚(Salmo salar)[6]、羅非魚(Oreochromis niloticus × O. aureus)[10]、石斑魚(Epinephelus malabaricus)[10]、河鱒(Salvelinus fontinalis)[11]、湖鱒(Salvelinus namaycush)[7]、鱈魚[5](Gadus morhua)、草蝦[12](Penaeus monodon)及中國(guó)對(duì)蝦[13](Penaeus chinensis)的維生素K需求量已經(jīng)確定, 分別為10、5.20、10.60、10、0.50—1.00、0.20、30—40、185 mg/kg飼料, 而斑點(diǎn)叉尾?和鯉魚飼料中則不需要額外添加維生素K[14,15]。

異育銀鯽是一種改良的鯉科魚類, 由于口味極好且生長(zhǎng)速度快而越來越受歡迎[16], 在我國(guó)已成為鯽魚養(yǎng)殖中的主要品系, 養(yǎng)殖面積與產(chǎn)量逐年增加,逐漸有取代鯉魚成為我國(guó)第二大淡水養(yǎng)殖魚類的趨勢(shì), 年產(chǎn)量為300萬(wàn)噸左右(中國(guó)漁業(yè)年鑒, 2010)。目前對(duì)異育銀鯽的蛋白、脂肪、碳水化合物、鈣、磷、銅、鋅等的需要量已有了較為具體的數(shù)據(jù)[17], 但有關(guān)異育銀鯽維生素需求方面的數(shù)據(jù)尚不完善, 僅有煙酸、維生素B2、維生素B6采用單因子梯度法得到了需求值[18,19]。維生素K作為一種重要的參與凝血作用的維生素, 異育銀鯽對(duì)其需求量還未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)的主要目的是通過飼料利用以及魚體血液指標(biāo)的變化來確定異育銀鯽對(duì)維生素K的最適需求量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以不含維生素的酪蛋白(Sigma; 粗蛋白含量為93.24%)為蛋白源, 玉米淀粉為碳水化合物來源, 玉米油: 大豆油(1∶1)為脂肪源配制成等氮(粗蛋白39.51%)等能(19.30 kJ/g飼料)的精制飼料。添加亞硫酸氫鈉甲萘醌維生素K3(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 上海, 生化試劑, 純度>94%)到基礎(chǔ)飼料中使維生素K3形成7個(gè)不同的水平, 為0、0.50、1、5、10、20、30 mg/kg飼料, 根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 7294-1987測(cè)定飼料中的維生素K3的含量為0.13、2.15、3.25、6.40、12、17.20、23.20 mg/kg。原料過40目篩混勻后用絞肉機(jī)制成直徑為3 mm的沉性飼料, 于70℃恒溫烘箱烘干后置于?4℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方(表1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚及飼養(yǎng)管理

本實(shí)驗(yàn)采用異育銀鯽, 為中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所關(guān)橋漁場(chǎng)的當(dāng)年幼魚, 在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖系統(tǒng)前, 用2%鹽水浸泡15min進(jìn)行消毒處理。在室內(nèi)圓形大缸(直徑: 150 cm, 高度: 120 cm, 體積1500 L)中馴養(yǎng)一個(gè)月, 暫養(yǎng)期間的飼料為本實(shí)驗(yàn)室配制的以紅魚粉和豆粕為蛋白源的顆粒飼料(粗蛋白為38%)。之后將實(shí)驗(yàn)魚轉(zhuǎn)入18個(gè)缸組成的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)(本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng))中馴養(yǎng)10d, 每天用不含維生素K的基礎(chǔ)飼料飽食投喂2次(09:00和15:00), 水溫25—29℃, 使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境和飼料。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及化學(xué)組成(%干重)Tab. 1 Formulation and chemical composition of the basal diet (in dry matter)

實(shí)驗(yàn)于2007年8月24日開始至2007年10月30日結(jié)束共70d。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為21個(gè)方形灰色塑料缸(水容量120 L)的流水系統(tǒng), 水流速為500 mL/min。實(shí)驗(yàn)期間, 通過向蓄水池中滴加20%的硫代硫酸鈉溶液調(diào)整曝氣自來水中的余氯, 使之低于0.05 mg/L。每天上午下午均測(cè)水溫, 保持在16—29.50℃(圖1)。實(shí)驗(yàn)期間, 每天2次飽食投喂(9:00和15:00), pH 6.7左右。氨氮濃度低于0.50 mg/L,溶氧高于5 mg/L。實(shí)驗(yàn)室用日光燈做光源, 光照周期為12L∶12D (光亮08:00—20:00)。

實(shí)驗(yàn)開始前, 將暫養(yǎng)魚禁食24h后集中, 隨機(jī)選擇體質(zhì)健壯、規(guī)格均勻的魚(尾均重2.1 g左右),帶水稱重, 隨機(jī)分組放入養(yǎng)魚缸中。實(shí)驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理, 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù), 每個(gè)缸放30尾魚, 各處理組之間魚初始均重沒有顯著差異(P>0.05), 同時(shí),隨機(jī)選取3組魚做初始魚樣, 每組帶水稱重后再抹干稱重, 以折算水分換算每缸魚的初始重量, 初始魚樣保存在?20℃冰箱中, 以備分析魚體成分。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間水溫變化圖Fig. 1 Water temperature variation during the experiment

1.3 取樣及分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行10周后, 實(shí)驗(yàn)魚禁食24h, 對(duì)每缸魚進(jìn)行計(jì)數(shù), 帶水稱重, 隨機(jī)取樣20 g左右終樣抹干,?4℃保存, 以備后期分析魚體的生化成分。隨機(jī)取3尾魚測(cè)全長(zhǎng)和體重, 并解剖取肝稱重, 用于計(jì)算肥滿度和肝體指數(shù)。另隨機(jī)取6尾魚尾靜脈取血, 其中三尾魚加抗凝劑肝素鈉, 取全血測(cè)紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、血球容積比, 另3尾魚不加抗凝劑,以3000 r/min離心15min, 吸取上層血清, 保存于?20℃冰箱中用于分析血清鈣含量。取5 μL全血迅速用生理鹽水稀釋200倍, 用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)得每毫升血液中的紅細(xì)胞數(shù)。取10 μL全血與鐵氰化鉀和氰化鉀反應(yīng)生成氰化高鐵血紅蛋白,在波長(zhǎng)540 nm處比色得血紅蛋白含量[20]。另取全血0.50—1 mL裝于帶有刻度的離心管中以4500 r/min離心15min, 紅血球在離心力作用下沉淀, 沉積的紅血球占全血量的百分比即為血球容積比。血清鈣含量的測(cè)定原理: 血清中鈣離子在堿性溶液中與甲基百里香酚藍(lán)結(jié)合, 生成藍(lán)色絡(luò)合物。通過比色與同樣處理的鈣標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較, 可計(jì)算出鈣的含量。

干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、灰分和能量的測(cè)定參照AOAC的方法[21]: 飼料干物質(zhì)測(cè)定在105℃烘干至恒重采用失重法; 初始和終末魚樣在高壓蒸汽滅菌器中(ES-315, TOMY KOGYO CO., Japan)120℃蒸30min, 搗爛混勻后放入恒溫烘箱中70℃烘干至恒重, 采用失重法計(jì)算其干物質(zhì)含量, 然后將烘干的魚樣粉碎后待分析。蛋白質(zhì)測(cè)定采用半微量凱氏定氮法(Kjeltec Auto Analyzer 2300, FOSS Company, USA); 脂肪測(cè)定采用索氏抽提法(Soxtec system HT 1043, Tecator, Extraction Unit, Hoganas, Sweden); 灰分測(cè)定采用馬福爐(中國(guó)湖北英山縣建力電爐制造廠)550℃焚燒法; 能值采用Phillipson 微量能量計(jì)(Phillipson microbomb calorimeter, Gentry Instruments Inc., Aiken, South Carolina, USA)測(cè)定。每個(gè)樣品至少測(cè)定兩個(gè)平行樣。

1.4 數(shù)據(jù)的處理

實(shí)驗(yàn)魚的攝食率(Feeding rate, FR)、特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, SGR)、飼料效率(Feed efficiency, FE)、肥滿度(Condition factor, CF)和肝體指數(shù)(Hepatosomatic index, HSI)計(jì)算公式如下:

攝食率[FR, %/(kg·d)]=100×總攝食量/[(初始體重+終末體重)/2]/天數(shù)

特定生長(zhǎng)率(SGR, %/d)=100×[(ln魚體末重)?(ln魚體初重)]/天數(shù)

飼料效率(FE, %)=100×(魚體末重?魚體初重)/攝食飼料干重

蛋白儲(chǔ)積率(PRE, %)=100×魚體蛋白質(zhì)儲(chǔ)積量/蛋白質(zhì)攝入量

肥滿度 (CF)=100×體重/體長(zhǎng)3

肝體比(HSI)=100×肝臟重/體重

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Statistia6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA), 用Duncan’s多重比較來確定各實(shí)驗(yàn)組間差異的顯著性。顯著水平為P<0.05,表中數(shù)據(jù)為三缸平行的平均值。

2 結(jié)果

2.1 在飼料中添加維生素K對(duì)異育銀鯽幼魚生長(zhǎng)、飼料利用和形體參數(shù)的影響

在飼料中添加維生素K對(duì)異育銀鯽幼魚生長(zhǎng)的影響(表2), 飼料中維生素K的添加可以明顯降低其攝食率, 當(dāng)飼料中維生素K含量為12 mg/kg時(shí)達(dá)到最小值(P<0.05)。特定生長(zhǎng)率隨著飼料中維生素K含量的增加呈上升的趨勢(shì), 但差異不顯著(P>0.05)。飼料效率受飼料中維生素K的影響與攝食率相反,隨著飼料中維生素K水平的增加, 飼料效率出現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)(P<0.05), 在12 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值。維生素K的添加對(duì)蛋白儲(chǔ)積率、肝體比和肥滿度均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 攝食不同維生素K水平飼料的異育銀鯽的生長(zhǎng)和飼料利用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab. 2 Effect of different dietary vitamin K levels on growth and feed utilization of juvenile gibel carp(Mean±SE)

如圖2所示, 通過折線回歸(Broken-line regression), 得到飼料效率(FE)和飼料維生素K水平的劑量效應(yīng)折線關(guān)系為: 1. y = 5.89x+26.94 (0.130.05。

兩條折線的交點(diǎn)即為異育銀鯽幼魚的維生素K需求量, 為3.73 mg/kg飼料。

如圖3所示, 飼料效率與特定生長(zhǎng)率呈正相關(guān)關(guān)系, 它們之間的關(guān)系表示為:

2.2 飼料中添加維生素K對(duì)異育銀鯽幼魚血液指

標(biāo)的影響

從圖4—7可以看出, 飼料中維生素K的添加可以顯著改變血液紅細(xì)胞數(shù)量, 使紅細(xì)胞數(shù)量呈先顯著升高, 在6.4 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值(P<0.05), 之后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)(P>0.05)。血紅蛋白含量、血球容積比、血清鈣含量在飼料中維生素K含量最低時(shí)均為最低值, 隨著維生素K的添加表現(xiàn)出升高的趨勢(shì),但差異不顯著(P>0.05)。

圖2 飼料中維生素K水平對(duì)異育銀鯽幼魚飼料效率的影響Fig. 2 Effect of dietary VK levels on FE of juvenile gibel carp

圖3 飼料效率與特定生長(zhǎng)率之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between FE and SGR

圖4 飼料中維生素K水平對(duì)異育銀鯽紅細(xì)胞數(shù)目的影響Fig. 4 Effect of dietary VK levels on RBC of juvenile gibel carp

圖5 飼料中維生素K水平對(duì)異育銀鯽血紅蛋白含量的影響Fig. 5 Effect of dietary VK levels on Hb of juvenile gibel carp

圖6 飼料中維生素K水平對(duì)異育銀鯽血球容積比的影響Fig. 6 Effect of dietary VK levels on Hct of juvenile gibel carp

圖7 飼料中維生素K水平對(duì)異育銀鯽血清鈣含量的影響Fig. 7 Effect of dietary VK levels on serum Ca of juvenile gibel carp

如圖8所示, 通過折線回歸(Broken-line regression), 得到紅細(xì)胞數(shù)目和飼料維生素K水平的劑量效應(yīng)折線關(guān)系為: 1. y = 13.79 x + 73.203 (0.13 < x < 3.25) R2= 0.8504, n = 4, P<0.05; 2. y = 165.94 (3.25 < x < 23.2) R2= 1, n = 4, P>0.05。兩條折線的交點(diǎn)即為異育銀鯽幼魚的維生素K需求量, 為6.72 mg/kg飼料。

圖8 飼料中維生素K水平對(duì)異育銀鯽幼魚紅細(xì)胞數(shù)目的影響Fig. 8 Effect of dietary VK level on RBC of juvenile gibel carp

2.3 飼料中添加維生素K對(duì)異育銀鯽幼魚魚體營(yíng)養(yǎng)成分的影響

從表3可以看出, 隨著飼料中維生素K的添加,魚體水分、粗脂肪有降低的趨勢(shì), 魚體粗蛋白有增加的趨勢(shì), 但差異都不顯著(P>0.05)。對(duì)魚體灰分亦無(wú)顯著影響(P>0.05)。

3 討論

在水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)維生素K需求量研究的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中, 分別以河鱒、湖鱒、大西洋鮭、鱈魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 發(fā)現(xiàn)隨著飼料中維生素K的添加可以提高魚類的生長(zhǎng)表現(xiàn)性能[5—7,11]。李貞儀在對(duì)羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn), 當(dāng)飼料維生素K含量從0增加到5 mg/kg時(shí),可以顯著提高魚體的生長(zhǎng)表現(xiàn)與飼料效率[10]。在對(duì)草蝦和中國(guó)對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn), 當(dāng)攝食含維生素K3的飼料時(shí), 其增重率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率均高于其他各組[12,13]。在本實(shí)驗(yàn)中得出了相似的結(jié)論,隨著飼料中維生素K含量的增加, 攝食率有下降的趨勢(shì), 飼料效率和生長(zhǎng)性能提高, 血液紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白含量也表現(xiàn)出增加的趨勢(shì), 但是差異均不顯著。而且在本實(shí)驗(yàn)中飼料效率與生長(zhǎng)呈正相關(guān)的關(guān)系, 說明飼料中添加維生素K對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要得益于飼料效率的提高。以飼料效率和紅細(xì)胞數(shù)目為指標(biāo)分別求得異育銀鯽對(duì)維生素K的需求量為3.73和6.72 mg/kg飼料。該需求量高于湖鱒(0.50—1 mg/kg)[7]、鱈魚(0.20 mg/kg)[5], 與羅非魚(5.20 mg/kg)[10]的需要量相似, 低于鮭魚(10 mg/kg)[6]、河鱒(10 mg/kg)[11]、石斑魚(10.60 mg/kg)[10]、草蝦(30—40 mg/kg)[12]和中國(guó)對(duì)蝦(185 mg/kg)[13]的需求量。造成水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)維生素K需求差異的因素有很多, 分析原因可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)短、飼料配方成分中的脂肪源、實(shí)驗(yàn)魚初始體重、年齡、品種上的不同等因素造成的。Suttie指出, 當(dāng)缺乏維生素K時(shí), 成鼠比幼鼠會(huì)晚出現(xiàn)缺乏癥[22]。李愛杰、Satoh, et al.也認(rèn)為不同年齡階段的魚對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的需求是不同的, 幼魚由于代謝強(qiáng)度大, 一般需求量要高于成魚[23,24]。此外, 不同品種也會(huì)影響其需求量, Will, et al.在雞和鼠的維生素K需求量的代謝比較上發(fā)現(xiàn), 由于雞的肝臟中維生素K過氧化還原酶僅有鼠的10%, 因此雞對(duì)維生素K的需求要高于鼠[25]。所以上述魚類對(duì)維生素K需求的不同也可能是因?yàn)榫S生素K循環(huán)作用中維生素K過氧化還原酶活性的差異造成的。蝦類對(duì)維生素K的需求一般比魚類高出許多, 推測(cè)原因可能是蝦類的攝食方式屬于抱食, 在攝食過程中會(huì)使得飼料中營(yíng)養(yǎng)素溶解于水中, 導(dǎo)致蝦類攝食更多營(yíng)養(yǎng)素滿足機(jī)體需要; 另外, 在機(jī)體的凝血過程中, 活化型的凝血因子X、鈣離子及其他數(shù)種因素的作用使非活性凝血因子Ⅱ轉(zhuǎn)變成活性凝血因子Ⅱ[26], 而甲殼類動(dòng)物在脫殼過程中需要大量鈣參與, 以至于無(wú)足夠的鈣參與凝血過程, 因此認(rèn)為蝦類的維生素K需求要高于魚類[12,13]。還有的魚不需要在飼料中額外添加維生素K, 比如斑點(diǎn)叉尾?[15]、鯉魚[14], 原因可能是因?yàn)檫@些魚的腸道微生物可以合成足量的維生素K供機(jī)體需要[11,27]。在哺乳動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn), 腸道微生物具有合成維生素K的能力, 而且飼料配方的組成和抗生素的添加會(huì)影響這一合成能力[26]。但是在本實(shí)驗(yàn)中并沒有相關(guān)數(shù)據(jù)來證明異育銀鯽腸道微生物合成維生素K的能力。

表3 攝食不同VK水平的飼料對(duì)異育銀鯽魚體營(yíng)養(yǎng)成分的影響(%濕重)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab. 3 Effect of dietary VK level on body composition of juvenile gibel carp (% wet weight) (Mean ± SE)

在河鱒[11]、鮭魚[6]、斑點(diǎn)叉尾?[15]的實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)飼料中維生素K缺乏時(shí), 分別會(huì)有鰓、眼睛、血管組織出血及體表出血等癥狀產(chǎn)生。在本實(shí)驗(yàn)中由魚體的外觀上雖然并未觀察到明顯的維生素K缺乏癥狀, 但是攝食最低維生素K含量飼料的魚血液中紅細(xì)胞數(shù)目顯著低于其他各組, 血紅蛋白含量、血球容積比、血清鈣含量的值也是各處理組中最低的,說明飼料中適量的維生素K對(duì)于維持血液中紅細(xì)胞生成能力、增加血紅素濃度與血球容積比是必需的。在河鱒[11]、湖鱒[7]及鮭魚[6]的研究中也有相同情形。本實(shí)驗(yàn)在外觀上沒有觀察到明顯的維生素K缺乏癥狀可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)周期還不夠長(zhǎng)[22], 因?yàn)轸~體內(nèi)多余的維生素K會(huì)在肝臟等組織中蓄積, 待機(jī)體需要時(shí)釋放出來利用, 因此其缺乏癥的出現(xiàn)需要的實(shí)驗(yàn)周期會(huì)很長(zhǎng)。在鱈魚、中國(guó)對(duì)蝦對(duì)維生素K的需求研究中, 實(shí)驗(yàn)周期分別為23周[5]、12周[13], 為研究鮭魚的維生素K缺乏癥, 實(shí)驗(yàn)周期為16周[6]。而在本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)周期為10周, 因此要觀察到其缺乏癥,可能還需要更長(zhǎng)的時(shí)間。在本實(shí)驗(yàn)中也沒有發(fā)現(xiàn)較高劑量維生素K對(duì)魚造成危害。在陸生動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 當(dāng)給予過高劑量維生素K時(shí)會(huì)產(chǎn)生溶血性貧血、高膽紅質(zhì)血癥及嚴(yán)重的黃疸癥等毒性現(xiàn)象[26]。在水產(chǎn)動(dòng)物方面, Poston在對(duì)河鱒進(jìn)行維生素K耐受性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給予過量的維生素K (100—2400 mg MSB/kg飼料)并不會(huì)產(chǎn)生與陸生動(dòng)物相似的毒性癥狀[27]。在對(duì)羅非魚[20]和鱈魚[5]的研究中卻發(fā)現(xiàn),飼料中過高含量的MSB對(duì)增重率有明顯的降低趨勢(shì), 可見, 不同的魚對(duì)高含量的MSB表現(xiàn)出了明顯不一樣的應(yīng)對(duì)策略, 這說明需要進(jìn)一步研究高含量的維生素K對(duì)魚類代謝的影響。

在動(dòng)物骨骼的象牙質(zhì)及礦物化組織中發(fā)現(xiàn)富含有維生素K依賴性蛋白質(zhì)—骨鈣素, 骨鈣素中有3個(gè)部位可提供與鈣離子結(jié)合的特殊鈣鍵結(jié)構(gòu), 參與骨骼組織中羥磷灰石的結(jié)合, 沉積于骨骼中[28]。Udagawa以底鳉(Fundulus heteroclitus)為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)未添加維生素K組的骨骼發(fā)生畸形的幾率會(huì)顯著高于攝食維生素K各組[29]。李貞儀在對(duì)羅非魚和石斑魚的研究中也發(fā)現(xiàn), 魚體鈣含量會(huì)隨著飼料中維生素K含量的增加而增加, 且維生素K與體內(nèi)鈣含量存在正相關(guān)的關(guān)系[10]。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是相似的, 在飼料中維生素K含量從0.13 mg/kg上升至6.40 mg/kg時(shí), 可以增加血清中游離鈣的含量, 說明維生素K的添加有助于鈣在體內(nèi)的生理功能的發(fā)揮, 也可以推測(cè)異育銀鯽體內(nèi)可能也存在骨鈣素, 進(jìn)而促進(jìn)骨骼中鈣離子的蓄積。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 攝食未添加維生素K組的異育銀鯽幼魚血液中紅細(xì)胞數(shù)目顯著低于維生素K添加組, 血紅蛋白含量、血球容積比和紅細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果相似, 隨著飼料中維生素K的添加有增加的趨勢(shì), 在對(duì)河鱒[11]、湖鱒[7]、石川氏鮭[8](Oncorhynchus rhodurus)、羅非魚[10]的研究中也有相同情形。說明飼料中添加適量的維生素K可以維持血液中紅細(xì)胞的生成能力, 使之維持在較佳的狀態(tài)。

綜上所述, 維生素K是維持異育銀鯽幼魚生長(zhǎng)、飼料利用、血液學(xué)指標(biāo)必需的維生素, 飼料中較高含量的維生素K (23.20 mg/kg)對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)沒有負(fù)面影響, 分別以飼料效率和血液紅細(xì)胞數(shù)目為評(píng)價(jià)指標(biāo), 異育銀鯽對(duì)維生素K的需要量為3.73—6.72 mg/kg飼料。

[1] Suttie J W. The metabolic role of vitamin K [J]. Federation of American Societies for Experimental Biology, 1980, 39(10): 2730

[2] Kormann A W, Weiser H. Protective functions of fat-soluble vitamins. In: Proceedings of the 37thNottingham Feed Manufacturer’s Conference, Nottingham, UK [C]. 1983, 346—355

[3] Udagawa M, Nakazoe J I, Murai T. Tissue distribution of phylloquinone and menaquinone-4 in sardine (Sardinops melanostictus) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology B, 1993, 106(2): 297—301

[4] Nestor K E, Conrad H R. Metabolism of vitamin K and influence on prothrombin time in milk-fed preruminant calves [J]. Journal of Dairy Science, 1990, 73(11): 3291—3296

[5] Grahl-Madsen E, Lie Q. Effects of different levels of vitamin K in diets for cod (Gadus morhua) [J]. Aquaculture, 1997, 151(1): 269—274

[6] Halver J E. The vitamins [A]. Fish Nutrition. New York: Academic Press. 1989, 31—109

[7] Poston H A. Relative effect of two dietary water-soluble analoguesos menaquinone on coagulation and packed cell volume of blood of lake trout (Salvelinus namaycush) [J]. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1976, 33(8): 1791—1793

[8] Taveekijakarn P, Miyazaki T, Matsumoto M, et al. Studies on vitamin K deficiency in amago salmon, Oncorhynchus rhodurus [J]. Journal of Fish Diseases, 1996, 19(13): 209—214

[9] Kitamura S, Suwa T, Ohara S, et al. Studies on vitamin requirements of rainbow troutⅡ. The defficiency symptoms fourteen kinds of vitamin [J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1967, 33(1): 1120—1125

[10] Li Z Y. Vitamin K requirements of juvenile hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) and grouper (Epinephelus malabaricus) [D]. Thesis for Master of Science. Taiwan Ocean University, Taiwan, China. 2003 [李貞儀. 吳郭魚稚魚與石斑魚稚魚對(duì)維生素K最適需求量之探討.臺(tái)灣海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文. 中國(guó)臺(tái)灣. 2003]

[11] Poston H A. Effect of vitamin K and sulfaguanidine on blood coagulation time, microhematocrit, and growth of immature brook trout [J]. Progressive Fish Culturist, 1964, 26(2): 59—64

[12] Shiau S Y, Liu J S. Quantifying the vitamin K requirement of juvenile marine shrimp, Penaeus monodon, with menadione [J]. Journal of Nutrition, 1994a, 124(2): 277—282

[13] Shiau S Y, Liu J S. Estimation of the dietary vitamin K requirement of juvenile Penaeus chinensis using menadione [J]. Aquaculture, 1994b, 126(1—2): 129—135

[14] National Research Council (NRC). Nutrition requirements of warmwater fishes and shellfish [A]. National Academy Press, Washington, USA. 1983, 1—78

[15] Murai T, Andrews J W. Vitamin K and anticoagulant relationships in catfish diets [J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1977, 43(1): 785—794

[16] Chen J L, Xie S Q, Zhu X M, et al. Dietary lipid sources for gibel carp Carassius auratus gibelio: growth performance, tissue composition and muscle fatty acid profiles [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(6): 989—997 [陳家林, 解綬啟, 朱曉鳴, 等. 不同脂肪源對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)、體組成和肌肉脂肪酸的影響. 水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35(6): 989—997]

[17] Xie S Q, Lei W, Zhu X M, et al．The Appraisal Data of Nutrition, Feed and Feeding Technology for Gibel Carp (Carassius auratus gibelio) [M]．2002, 3 [解綬啟, 雷武, 朱曉鳴, 等. 異育銀鯽營(yíng)養(yǎng)、飼料與投喂技術(shù)成果鑒定技術(shù)數(shù)據(jù)集. 2002, 3]

[18] Wang J L. Dietary riboflavin, pyridoxine, niacin requirement of juvenile gibel carp (Carassius auratus gibelio) [D]. Thesis for Master of Science. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan. 2007 [王錦林. 異育銀鯽對(duì)維生素B2、維生素B6和煙酸的需求量的研究. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所碩士學(xué)位論文, 武漢. 2007]

[19] Wang J L, Zhu X M, Lei W, et al. Dietary vitamin B6 requirement of juvenile gibel carp, Carassius auratus gibelio [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(1): 98—104 [王錦林, 朱曉鳴, 雷武，等. 異育銀鯽幼魚對(duì)飼料中維生素B6需求量的研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35(1): 98—104]

[20] Zhang R M. The problem in application and quality control of cyanide methemoglobin method [J]. Chinese Journal of Medical Laboratory Technology, 1980, 3(3): 164 [章榮明.氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定在推廣應(yīng)用中得若干問題及其質(zhì)量控制. 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志, 1980, 3(3): 164]

[21] AOAC. Official Methods of Analysis [A]. 14th edn. Washington D C: Association of Official Analytical Chemists. 1984, 152—163

[22] Suttie J W. Vitamin K [A]. In: Machlin L J(Eds.), Handbook of vitamins. Marcel Dekker, Inc., New York and Vasel. 1991, 145—194

[23] Li A J. Aquatic Animal Nutrition and Feed [M]. Beijing: Chinese Agricultural Press. 1996, 20 [李愛杰. 水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué). 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.1996, 20]

[24] Satoh S, Hernández A, Tokoro T, et al. Comparison of phosphorus retention efficiency between rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed a commercial diet and a low fish meal based diet [J]. Aquaculture, 2003, 224(1): 271—282

[25] Will B H, Suttie J W. Comparative metabolism of phylloquinone and requirement of vitamin K in chicks and rats [J]. Journal of Nutrition, 1992, 122(1): 2354—2360

[26] Groff J L, Gropper S S. Vitamin K [A]. In: Groff J L, Gropper S S (Eds.), Advanced nutrition and human metabolism, 3rdedn. Wadsworth, USA. 1999, 351—358

[27] Poston H A. Effect of excess vitamin K on growth, coagulation time and hematocrit values of brook trout fingerlings [J]. Fisheries Research Bulletin, 1971, 34(1): 41—43

[28] Binkley N C, Suttie J W. Vitamin K nutrition and osteoporosis [J]. Journal of Nutrition, 1995, 125(7): 1812—1821

[29] Udagawa M. The effect of dietary vitamin K (phylloquinone and menadione) levels on the vertebral formation in mummichog Fundulus heteroclitus [J]. Fisheries Science, 2001, 67(1): 104—109

DIETARY VITAMIN K REQUIREMENT OF JUVENILE GIBEL CARP (CARASSIUS AURATUS GIBELIO)

DUAN Yuan-Hui1,2, ZHU Xiao-Ming1, HAN Dong1, YANG Yun-Xia1, JIN Jun-Yan1and XIE Shou-Qi1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

A 10-week feeding experiment was conducted to determine vitamin K requirement of juvenile gibel carp (Carassius auratus gibelio). Purified diets with seven levels (0.13, 2.15, 3.25, 6.40, 12, 17.20 and 23.20 mg/kg diet) of supplemental vitamin K3(menadione sodium bisulfite, MSB) were fed to C. gibelio (mean weight 2.17±0.01 g). Each diet was fed to triplicate groups of fish. The results showed that fish fed with the diet supplemented with 2.15 mg vitamin K/kg had significantly higher feeding rate (FR) than fish fed with diets supplemented with 12 mg vitamin K/kg (P<0.05). Specific growth rate (SGR) increased with increasing dietary vitamin K levels and reached the highest value when dietary vitamin K content was 12 mg/kg (P>0.05). Feed efficiency (FE) was the highest in fish fed with diet supplemented with ≥3.25 mg vitamin K/kg, intermediate with 2.15 mg vitamin K/kg supplemented diet and the lowest in the control group (P<0.05). FE reached the highest value when the dietary vitamin K content was 12 mg/kg (P<0.05) and showed a linear correlation with SGR (SGR = 0.01 FE + 0.95, R2= 0.95). The number of red corpuscles (RBC) in blood increased significantly with increasing dietary vitamin K level (P<0.05) and reached the plateau at 6.40 mg vitamin K/kg. The Hb content, Hct and serum Ca content followed the same trend as RBC and were the lowest in gibel carp fed with diet without vitamin K supplementation (P>0.05). HSI, CF and whole body composition were not affected by dietary vitamin K level (P>0.05). Based on the broken-line regression between FE or RBC and dietary vitamin K level, we concluded that the adequate supplemental dietary vitamin K content for gibel carp was 3.73—6.72 mg/kg.

Gibel carp; Vitamin K; Feed utilization; Haemotological index; Requirement

S965

A

1000-3207(2013)01-0008-08

10.7541/2013.8

2011-11-21;

2012-10-29

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-46-19); 國(guó)家973項(xiàng)目(2009CB118702); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)(201003020, 201203015, 201203083); 國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)基金(31123001)和FEBL(2009FBZ03)資助

段元慧(1983—), 女, 山東萊蕪人; 博士研究生; 研究方向?yàn)轸~類生理生態(tài)學(xué)。E-mail: joydyh1983@163.com

解綬啟, E-mail: sqxie@ihb.ac.cn