肖明松 崔 峰 康 健 馬玉涵

(安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 鳳陽 233100)

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑 蛋白酶K、瓊脂糖、飽和酚購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司, 引物DL1 (5′-AC CCCTGGCTCCCAAAGC-3′) 和 DH2 (5′-ATCTTAG CATCTTCAGTG-3′)[18]由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,Taq酶、dNTPs 購自大連TaKaRa公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器 PCR 儀、核酸分析儀和離心機(jī)為Eppendorf (德國), Alphalmager Is-2200凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國), 電泳儀等常規(guī)儀器均為國產(chǎn)。

1.2 方法

模板 DNA的制備 每個樣品隨機(jī)取肌肉100—200 mg, 剪碎, 勻漿后置于1.5 mL 的微量離心管中, 加入含蛋白酶K 的裂解液(10 mmol/ L Tris-HCl, pH 8.0, 1 mmol/ L EDTA, pH 8.0, 1%SDS) ,55℃消化過夜。次日分別用Tris-飽和酚、氯仿/異戊醇(24∶1) 提取、純化DNA, 之后用?20℃冷凍的無水乙醇沉淀DNA, 自然干燥后, 溶于滅菌雙蒸水中,所得用基因組 DNA 樣品用紫外分光光度計測量DNA 樣品的濃度和純度, 同時輔以瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組 DNA 的完整性并估測分子量, 置于?20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)總體積為 30 μL, 其中含 10×buffer反應(yīng)緩沖液 3.0 μL, 3 μL dNTP(2.5 mmol/L), 0.4 μmol/L 引物, 0.25 μLTaq酶, 25 ng DNA, 用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)條件為： 94℃下預(yù)變性5min, 94℃下變性30s, 58℃下退火1min, 72℃下延伸1min, 共35個循環(huán), 最后72℃下延伸10min, 4℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2 %的瓊脂糖凝膠(含0.5 g/mL EB) 上電泳, 120 V 穩(wěn)壓電泳1h。電泳結(jié)果在Alphalmager Is-2200'凝膠圖像分析系統(tǒng)中拍照、保存。

DNA序列測定和分析 經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 將 PCR 產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定, 測得的序列用Clustal X 1.81 程序[19]進(jìn)行比對, 并輔以人工校對, 進(jìn)行同源性比較。所有序列均遞交 GenBank (序列號為JN131500-JN131517和 AB054127-AY297099)。利用MEGA 3.0 軟件包[20]分析序列特征、統(tǒng)計堿基組成和轉(zhuǎn)換與顛換值、計算遺傳差異和遺傳距離。采用鄰接法(Neighbor-joining tree, NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹, 系統(tǒng)樹各分支的置信度由 1000次自舉法(Bootstrap)檢驗(yàn)。利用DnaSP 4.0軟件[21]計算各群體的單倍型多樣度(H)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、核苷酸多態(tài)性(Pi); Arlequin 3.1軟件[22]進(jìn)行群體間的歐氏距離平方(Squared euclidean distance) 矩陣分子變異分析(AMOVA), 統(tǒng)計長吻養(yǎng)殖群體與野生群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst), 并根據(jù)Nm≈(1?Fst)/(2Fst)得到群體間的基因流值(Nm)。為進(jìn)行譜系生物地理學(xué)(Phylogeography)分析, 利用 TCS 1.21[23]軟件, 依據(jù)統(tǒng)計簡約原理[24], 構(gòu)建單倍型的網(wǎng)狀圖。相對于傳統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育分析方法, 網(wǎng)狀圖更能夠有效地揭示種群水平上的譜系關(guān)系(Genealogical relationship),更清楚地反映與種內(nèi)基因進(jìn)化有關(guān)的特性, 如是否保持祖先的單倍型、是否存在多重后代的單倍型以及種群間的序列差異較低的特性[25]。

2 結(jié)果

2.1 長吻線粒體控制區(qū)序列變異、單倍型和單倍型分布

8個, 缺失位點(diǎn)1個。含有4個轉(zhuǎn)換位點(diǎn)(Ts), 1個顛換位點(diǎn)(Tv), 平均轉(zhuǎn)顛換比(Ts/Tv)為8.27。在長吻野生群體中, 69個個體共檢測到 35個變異位點(diǎn)(占全部堿基數(shù)的4.43%)。其中簡約信息位點(diǎn)24個, 單突變位點(diǎn)10個, 缺失位點(diǎn)1個。含有5個轉(zhuǎn)換位點(diǎn)(Ts), 1個顛換位點(diǎn)(Tv), 平均轉(zhuǎn)顛換比(Ts/Tv)為9.80。在長吻養(yǎng)殖群體和野生群體中, 135個個體共檢測到42個變異位點(diǎn), 其中簡約信息位點(diǎn)28個,單突變位點(diǎn)12個, 缺失位點(diǎn)2個(表1)。長吻養(yǎng)殖群體和野生群體的堿基變化不大(表2), 其中堿基G的含量顯著低于其他堿基的含量, A+T含量(60.6%)明顯高于C+G含量(39.4%)。

表1 長吻線粒體控制區(qū)單倍型分布及單倍型的變異位點(diǎn)Tab.1Alignment of mtDNAcontrol region haplotypes of variable positions and distribution of mtDNAcontrol region haplotypes of Leiocassis longirostris

表1 長吻線粒體控制區(qū)單倍型分布及單倍型的變異位點(diǎn)Tab.1Alignment of mtDNAcontrol region haplotypes of variable positions and distribution of mtDNAcontrol region haplotypes of Leiocassis longirostris

計合316311161491 011 11136121129京111311111南慶安11313 ation漢武1 2111 Situ點(diǎn)地慶1 41 211重南淮4 455213首3 1 23石山2311511 2眉7 7 1 3 9 1 TA................................................................A........CG.....T................................TC..............................................AT..............................................TC......................................G.......6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 3 4 4 5 5 6 6 6 8 8 7 0 3 2 7 6 7 8 3 4 GA.......... A.. A.. A.. A.. A.. A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... .AG G A G A.A.A.. ... ... .GC............A.A.A........................T......AG..4 4 5 5 5 6 6 6 6 6 0 5 2 4 9 0 1 2 3 3 2 9 9 6 2 1 1 9 2 4..............................TA.G.G.G.G.G.G..................G...................A...CT...................................A.A.A.A.A.A.A.A CA.1 1 1 2 3 3 3 3 3 6 7 9 6 0 0 2 3 3 7 2 1 2 1 2 6 1 9................G.......TA...........T.T.T.T.T.T....C..T.T.T.T.T.T.T.T TC.C.C.C.C.C T C..C.C.C.C.....C.C C..C.C.C.C.C.C.C.C.............C.C.C.C.C.C.C.C.C.C.C.C.C.C.C.C TA...................................C......G.G.CA....1 1 1 TG.. T 1 1 2 4 5 6 7 8 2 3 5 8 9 8 9 9 4 2 8 6 4 2.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A C. .C. .C. .C. .C. .C. .C. .C. .CTTC.T.T.T.T.T.C.T.C.T.C.C.T...T...T...C.T...T...T...C C T..T.T...T.T...T...T.T.T.T..AA...C..........CC.........T.T.T G...............................................T............G................e型倍單Haplotyp H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 H-7 H-8 H-9 H-10 H-11 H-12 H-13 H-14 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 H-21 H-22 H-23 H-24

2.2 單倍型分布及單倍型聚類分析

利用DnaSP 4.0 軟件計算各群體的單倍型(表1)。由表1可知, 在長吻不同群體中, 135個體共檢測出46 個單倍型, 即H-1 - H-46。其中28個獨(dú)享單倍型, 占 20.74%,18個共享單倍型, 單倍型 H-8、H-11、H-12、H-14、H-18、H-24、H-37和 H-43為野生群體和養(yǎng)殖群體共享。另外, 在長吻養(yǎng)殖群體中, 66個體共檢測出 18 個單倍型, 在野生群體中 69個體共檢測出36 個單倍型(表略)。TCS 1.21軟件生成的統(tǒng)計簡約網(wǎng)狀圖顯示出星狀的分布態(tài)勢,沒有將 46個單倍型區(qū)分為對應(yīng)不同地理區(qū)域或者地理種群的單系群。單倍型H- 14位于星狀圖的中心,其他單倍型則與其依短支相連(圖1)。依據(jù)溯祖理論 (Coalescence theory), 線粒體控制區(qū)單倍型的星狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明所研究的種群經(jīng)歷了明顯的種群擴(kuò)張[26], 單倍型 H-14由于其分布最廣和享有該單倍型的個體在所有的種群中所占的比重也明顯的高于其他單倍型, 而且在網(wǎng)狀圖中處于基部位置, 說明單倍型 H-14可能是原始的單倍型。

表2 長吻序列堿基組成Tab.2 Nucleotide compositions of mtDNA control region in Leiocassis longirostris

表2 長吻序列堿基組成Tab.2 Nucleotide compositions of mtDNA control region in Leiocassis longirostris

群體 Populations T C A G眉山 Meishan 31.6 25.2 29.1 14.1石首 Shishou 31.5 25.2 29.1 14.2淮南 Huainan 31.5 25.3 29.0 14.2平均Average 31.6 25.2 29.0 14.2重慶 Chongqing 31.5 25.3 29.1 14.1武漢 Wuhan 31.5 25.3 29.1 14.1安慶 Anqing 31.5 25.3 29.0 14.2南京 Nanjing 31.5 25.3 29.1 14.1平均 Average 31.5 25.3 29.1 14.1

圖1 基于線粒體控制區(qū)單倍型的統(tǒng)計簡約網(wǎng)狀圖Fig.1 The statistical parsimony network inferred from mtDNA control region haplotypes

2.3 群體遺傳多態(tài)性參數(shù)統(tǒng)計

利用 DnaSP 4.0 軟件計算各群體的單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、核苷酸多態(tài)性(Pi)。由表3可知, 長吻4個野生群體的單倍型多樣性Hd值均較高, 而從衡量群體遺傳水平的K值和Pi值來看, 重慶野生群體明顯高于其他群體。長吻3個養(yǎng)殖群體的平均單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性相對較低 (Hd=0.8867±0.0013,Pi=0.0056±0.0013)。

2.4 群體遺傳分化

群體間的序列差異反映的是生物間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近, 使用MAGA 3.0 軟件中Tamura-Nei 模型計算群體內(nèi)及群體間的遺傳距離(表4)。結(jié)果表明, 四川眉山和湖北石首人工養(yǎng)殖群體間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),而安徽淮南養(yǎng)殖群體與湖北石首和四川眉山人工養(yǎng)殖群體間的親緣關(guān)系較近, 長吻養(yǎng)殖群體與野生群體存在一定的遺傳距離。分子變異分析(AMOVA)的結(jié)果表明, 長吻群體內(nèi)存在較高的遺傳變異(96.42%), 而群體間的遺傳變異較小(3.21%) (表 5),分子遺傳變異主要來自地理區(qū)內(nèi)群體內(nèi)個體間。7個群體兩兩比較的遺傳分化指數(shù)(Fst)顯示, 安慶群體和石首群體之間的遺傳分化最大(Fst=0.1125), 而武漢群體和安慶群體之間的遺傳分化最小(Fst=0.0014), 其中長吻養(yǎng)殖群體間的遺傳分化高于野生群體間的遺傳分化。 此外, 群體間的遺傳距離分析與遺傳分化指數(shù)的分析結(jié)果是一致(表 4)。Arlequin 3.1 軟件統(tǒng)計養(yǎng)殖群體與野生群體間的遺傳分化指數(shù)和基因流分別為Fst=0.0358、Nm=13.47。

表3 長吻7個群體遺傳多樣性統(tǒng)計參數(shù)Tab.3 Demographic parameters estimated from seven Leiocassis longirostris populations

表3 長吻7個群體遺傳多樣性統(tǒng)計參數(shù)Tab.3 Demographic parameters estimated from seven Leiocassis longirostris populations

群體 Populations 單倍型多樣性 Hd 平均核苷酸差異數(shù) K 核苷酸多樣性 Pi眉山 Meishan 0.8972±0.0361 4.8854 0.0064±0.0013石首 Shishou 0.8580±0.0570 4.3500 0.0049±0.0021淮南 Huainan 0.9048±0.0260 4.9444 0.0056±0.0011平均 Average 0.8867±0.0013 4.7266 0.0056±0.0013重慶 Chongqing 0.9470±0.0320 6.5580 0.0083±0.0008武漢 Wuhan 0.9810±0.0310 6.1520 0.0078±0.0007安慶 Anqing 0.9170±0.0420 3.9580 0.0050±0.0006南京 Nanjing 0.9430±0.0540 4.2860 0.0054±0.0007平均 Average 0.9736±0.0070 5.3030 0.0087±0.0015

表4 長吻群體間的遺傳分化指數(shù)(左下角)和遺傳距離(右上角)Tab.4 Fixation Index (F) (below) and genetic distance (above) in three populations of Leiocassis longirostris

表4 長吻群體間的遺傳分化指數(shù)(左下角)和遺傳距離(右上角)Tab.4 Fixation Index (F) (below) and genetic distance (above) in three populations of Leiocassis longirostris

群體 Populations 眉山Meishan石首Shishou淮南Huainan重慶Chongqing武漢Wuhan安慶Anqing南京Nanjing眉山Meishan — 0.006 0.006 0.007 0.007 0.006 0.006石首Shishou 0.1024 — 0.005 0.007 0.007 0.006 0.006淮南Huainan 0.0391 0.0991 — 0.007 0.007 0.006 0.006重慶Chongqing 0.0600 0.0909 0.0654 — 0.008 0.007 0.007武漢Wuhan 0.0195 0.0691 0.0358 0.0086 — 0.007 0.007安慶Anqing 0.0683 0.1125 0.0514 0.0551 0.0014 — 0.006南京Nanjing 0.0335 0.0660 0.0036 0.0335 0.0016 0.0277 —

表5 長吻?群體分子變異分析結(jié)果Tab.5 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the Leiocassis longirostris populations

2.5 群體間的親緣關(guān)系及聚類分析

圖2 長吻各單倍型基于線粒體控制區(qū)序列構(gòu)建的NJ樹Fig.2 NJ tree based on the control region of 7 populations of Leiocassis longirostris

3 討論

3.1 長吻群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性的研究是生物多樣性研究的重要內(nèi)容, 只有通過遺傳多樣性的研究才能從本質(zhì)上揭示物種多樣性的起源、變異和進(jìn)化。核苷酸多態(tài)性(Pi)作為一個衡量群體間遺傳多態(tài)性的重要指標(biāo), 表示各種 mtDNA 單倍型在群體中所占的比例。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知, 在長吻養(yǎng)殖群體中66個個體線粒體控制區(qū)790 bp的序列中, 總核苷酸突變位點(diǎn)為27個,共檢測出18個單倍型。長吻野生群體中69個個體共檢測到35個變異位點(diǎn), 36個單倍型。與長吻野生群體相比, 養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平均較低(Hd=0.8867±0.0013,Pi=0.0057±0.0013)。另外, 從 3個養(yǎng)殖群體內(nèi)部的核苷酸位點(diǎn)突變情況來看, 安徽淮南群體內(nèi)有22個核苷酸位點(diǎn)的變異, 湖北石首群體共產(chǎn)生12個變異位點(diǎn), 四川眉山群體有17個變異位點(diǎn), 分別只占總?cè)后w變異的81.48%、44.44%和62.96%。這表明遺傳變異主要存在于群體內(nèi), 群體間的基因變異較小。安徽淮南群體的基因多樣性水平最高, 石首和眉山河群體較低。Wang,et al.[27]對取自長江上游和下游的野生長吻進(jìn)行 PCR–RFLP分析, 發(fā)現(xiàn)野生長吻遺傳多樣性低, 種群數(shù)量下降, 這與已有野生種群的研究相一致[28,29]。而Yang,et al.[30]利用線粒體控制序列和核SSR標(biāo)記研究長江上游、中游和下游野生長吻遺傳變異和種群結(jié)構(gòu), 表明長江野生長吻單倍型多樣性較高, 核苷酸多樣性水平較低(Hd=0.9770±0.0041,Pi=0.0081±0.0043)。上述研究結(jié)果表明, 長吻長期的人工養(yǎng)殖已使得該群體的遺傳多樣性水平明顯降低, 反映了長吻作為我國鯰形目分布最廣且產(chǎn)量較高的特產(chǎn)淡水名貴經(jīng)濟(jì)魚類特殊的生命進(jìn)化歷程和適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境的能力。造成這一現(xiàn)象的主要原因可能是長吻的基礎(chǔ)群體數(shù)量較小、養(yǎng)殖過程的近交及遺傳漂變等。而相對較高Hd值、低Pi值表明長吻這個群體可能是由一個較小的有效群體迅速增長, 盡管變異導(dǎo)致單倍型的多態(tài)性的積累, 但核苷酸序列的多樣化還未能積累[31]。高的Hd為通過分子選育等技術(shù)有效防止品種退化提供了前提條件, 并為保持遺傳多樣性水平, 維持雜交選育優(yōu)勢提供了重要基礎(chǔ)。這也在一定程度上說明定期補(bǔ)充不同地區(qū)不同群體的個體作為親魚進(jìn)行繁育有利于保持長吻人工繁殖群體的遺傳多樣性, 避免近親繁殖和瓶頸效應(yīng)。

3.2 長吻群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

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