沈斌乾陳建明郭建林潘 茜孫麗慧葉金云

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001; 2. 湖州師范學(xué)院, 湖州 313001)

飼料中添加枯草芽孢桿菌對青魚生長、消化酶活性和魚體組成的影響

沈斌乾1陳建明1郭建林1潘 茜1孫麗慧1葉金云2

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001; 2. 湖州師范學(xué)院, 湖州 313001)

用不加枯草芽孢桿菌的對照飼料和分別添加2×106、2×107、2×108和5×108cfu/g枯草芽孢桿菌的4種實(shí)驗(yàn)飼料, 分別喂養(yǎng)初始均重為(4.16±0.03) g的5組三重復(fù)的青魚魚種8周。飼養(yǎng)試驗(yàn)在15只容積為80 L循環(huán)式水簇箱內(nèi)進(jìn)行, 水溫控制為(25±0.5) ℃。結(jié)果表明: 飼料中添加枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組青魚魚體終重和魚體增重比不添加的飼料組顯著提高, 而飼料系數(shù)則顯著降低(P<0.05), 不同枯草芽孢桿菌添加量對青魚魚體增重和飼料系數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。飼料中添加枯草芽孢桿菌對青魚的成活率無顯著影響(P>0.05)。青魚攝食添加枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料后其腸蛋白酶活性比不添加組顯著升高(P<0.05), 并隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而顯著上升(P<0.05), 但添加量到2×107cfu/g后繼續(xù)增加則不再顯著變化(P>0.05)。青魚攝食添加枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料后, 其腸淀粉酶活性均比不添加組顯著升高(P<0.05), 且隨枯草芽孢桿菌添加量增大呈不斷升高的趨勢。青魚攝食添加2×107、2×108和5×108cfu/g枯草芽孢桿菌的飼料后, 其肝胰臟蛋白酶活性顯著高于攝食不添加或添加2×106cfu/g枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。青魚攝食添加枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料后, 其肝胰臟淀粉酶、肝胰臟脂肪酶和腸脂肪酶的活性均與不添加的實(shí)驗(yàn)組無顯著差異(P>0.05)。青魚魚種攝食添加枯草芽孢桿菌的飼料與攝食不添加枯草芽孢桿菌的飼料相比, 其全魚營養(yǎng)組成均無顯著差異(P>0.05)。因此, 在實(shí)驗(yàn)條件下, 飼料中添加2×106—5×108cfu/g的枯草芽孢桿菌能促進(jìn)青魚魚種的生長和降低飼料系數(shù), 而對魚體組成沒有影響。

枯草芽孢桿菌; 青魚; 生長; 消化酶活性; 全魚組成

在養(yǎng)殖魚類上應(yīng)用的益生菌是指添加到飼料或應(yīng)用于養(yǎng)殖水中在一定程度上改善養(yǎng)殖魚的水環(huán)境或腸道內(nèi)微生物平衡, 從而對寄主產(chǎn)生包括刺激免疫、提高抗病力、降低脅迫反應(yīng)、改善胃腸道形態(tài)、增進(jìn)食欲、促進(jìn)生長和飼料利用、改善魚肉品質(zhì)等有利影響的微生物細(xì)胞[1]。芽孢桿菌屬的一些菌種(Bacillus spp.) 因具抗逆性強(qiáng), 易儲(chǔ)存等獨(dú)特的生物學(xué)特性而受到人們廣泛的關(guān)注, 是水產(chǎn)養(yǎng)殖中研究和使用較多的一類益生菌。而且, 枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌 (B. licheniformis)已在我國得到批準(zhǔn)可用作飼料添加劑?？莶菅挎邨U菌制劑添加到一些魚蝦飼料的應(yīng)用試驗(yàn)表明, 飼料中添加芽孢桿菌能改變那些魚蝦腸道內(nèi)細(xì)菌群落, 顯著提高消化酶的活性和非特異性免疫反應(yīng), 促進(jìn)生長[2—8]。但有關(guān)枯草芽孢桿菌在青魚飼料中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本研究通過在飼料中添加枯草芽孢桿菌開展青魚飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn), 以期評估飼料中枯草芽孢桿菌對青魚生長性能、消化酶活性和魚體組成的影響,為青魚飼料中合理應(yīng)用枯草芽孢桿菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芽孢桿菌制劑

實(shí)驗(yàn)用芽孢桿菌制劑是由本所魚病室從水產(chǎn)養(yǎng)殖土壤中分離獲得的枯草芽孢桿菌B115菌株, 經(jīng)30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)后的菌液。使用前用平板計(jì)數(shù)法測定制劑中細(xì)菌數(shù)量。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

以褐魚粉、豆粕、菜籽粕和面粉等為主要原料配制基礎(chǔ)飼料, 其配方的原料組成(表1)。在基礎(chǔ)配方的基礎(chǔ)上, 分別加入0、2×106、2×107、2×108和5× 108cfu/g的枯草芽孢桿菌配制5種實(shí)驗(yàn)用飼料。飼料制作時(shí), 先將原料粉碎, 使原料粉末能全部通過孔徑為0.355 mm試驗(yàn)篩, 按配方比例稱取各原料置于盆內(nèi)混合均勻, 加入適量的水或枯草芽孢桿菌與水混合物, 再次充分混勻后, 用絞肉機(jī)制成直徑約為1.2 mm的面條狀飼料, 在室溫下風(fēng)干后制成顆粒, 在4℃下保存?zhèn)溆?。各飼料的營養(yǎng)成分分析結(jié)果(表2)。

表1 基礎(chǔ)飼料原料組成(%干飼料)Tab. 1 Formulation of basal diet (% dry diet)

表2 實(shí)驗(yàn)飼料的營養(yǎng)成分分析(%干飼料)Tab. 2 Nutritional facts of the test diets (% dry diet)

1.3 實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)魚種取自本所實(shí)驗(yàn)魚場同一培育池的當(dāng)年魚種, 平均尾重(4.16±0.03) g。實(shí)驗(yàn)前于水泥池用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)二周后隨機(jī)分養(yǎng)到5組各3個(gè)重復(fù)的15只水族箱, 每箱放魚25尾。

1.4 飼養(yǎng)方法與水質(zhì)

實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)在容積為80L循環(huán)式水簇箱中。每只水簇箱各配一氣石, 連續(xù)充氣。每天9:00和15:00各投飼一次, 每次均用人工投喂至接近飽食, 日投飼料量約占魚體重的3%。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周。飼養(yǎng)期間, 水溫(25±0.5)℃; 水質(zhì): pH 7.1—7.3、DO 4.19—5.68 mg/L、NH3-N 0.13—0.21 mg/L、NO2-N 0.06—0.08mg/L; NO3-N 0.13—0.25 mg/L。實(shí)驗(yàn)期間光照時(shí)間用日光燈進(jìn)行控制, 黑夜∶白晝?yōu)?2h∶12h。

1.5 取樣與分析

飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)完成后饑餓1d, 每箱取5尾實(shí)驗(yàn)魚為一混合樣, 供營養(yǎng)組成測定。飼料和全魚營養(yǎng)成分測定方法為: 105℃常壓干燥法測定水分; 微量凱氏定氮法測定粗蛋白; 用無水乙醚為溶劑, 索氏抽提法測定粗脂肪; 箱式電阻爐550℃灼燒法測定粗灰分。上述測定步驟均參照AOCO的方法進(jìn)行[9]。

取飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后饑餓1d后的實(shí)驗(yàn)魚, 置冰盤上解剖, 取出全部肝胰臟和消化道, 剔除脂肪和消化道內(nèi)容物, 分別取肝胰臟和腸(每一水簇箱5尾實(shí)驗(yàn)魚為一混合樣), 用濾紙吸干水分后稱重, 加入10倍的PBS溶液, 用玻璃勻漿器在冰浴中手工勻漿。隨后在4℃、10000r/min離心10min, 獲得的上清液即為粗酶液, 并置于4℃冰箱中待用。蛋白酶活性測定采用福林試劑法[10]。蛋白酶活性單位定義為: 在pH 7.5、37℃條件下, 每分鐘酶解酪蛋白生成1 μg酪氨酸為1個(gè)活性單位(U)。蛋白酶活性以U/mg粗酶蛋白表示。淀粉酶活力測定采用Benfeld法[11]。淀粉酶活性單位定義為: 在pH 6.9、25℃條件下,每分鐘酶解可溶性淀粉生成1 μmol麥芽糖為1個(gè)活性單位(U)。淀粉酶活性以U/mg粗酶蛋白表示。脂肪酶活性采用組織脂肪酶的測定試劑盒方法(南京建成)。脂肪酶活性單位定義: 在37℃條件下, 每分鐘酶解1 μmol底物為1個(gè)活力單位(U)。脂肪酶活性以U/g粗酶蛋白表示。粗酶液中蛋白濃度用考馬斯亮藍(lán)法測定[12]。以牛血清白蛋白為基準(zhǔn)物。

1.6 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA), 以檢驗(yàn)不同實(shí)驗(yàn)組間各指標(biāo)平均值是否存在顯著性差異。如有顯著差異(P<0.05), 則作Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 魚體生長情況

青魚魚種攝食不同飼料8周后的魚體生長情況(表3)。從表3可見, 在飼料中添加2×106—5×108cfu/g的枯草芽孢桿菌, 青魚的魚體終重和魚體增重比不添加的飼料組顯著提高, 而飼料系數(shù)則顯著降低(P<0.05), 而不同枯草芽孢桿菌添加量對青魚的生長和飼料系數(shù)無顯著影響(P>0.05)。在飼料中添加枯草芽孢桿菌對青魚的成活率無顯著影響(P>0.05)。

2.2 腸和肝胰臟消化酶活性

青魚魚種攝食不同飼料8周后的腸和肝胰臟消化酶活性測定結(jié)果(表4)。青魚攝食添加枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)飼料后其腸蛋白酶活性比不添加組顯著升高(P<0.05), 并隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而不斷上升(P<0.05), 但添加量到2×107cfu/g后繼續(xù)增加則不再顯著變化(P>0.05)。青魚攝食添加2×106—5×108cfu/g的枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料后,其腸淀粉酶活性均比不添加組顯著升高(P<0.05),且隨枯草芽孢桿菌添加量的增大呈不斷升高的趨勢。青魚攝食添加2×107、2×108和5×108cfu/g枯草芽孢桿菌的飼料后, 其肝胰臟蛋白酶活性顯著高于攝食不添加或添加2×106cfu/g枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。青魚攝食添加枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)飼料后, 其肝胰臟淀粉酶、腸脂肪酶和肝胰臟脂肪酶的活性均與攝食不添加枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組無顯著差異(P>0.05)。

表3 青魚魚種攝食不同飼料8周后的魚體生長情況Tab. 3 Growth performance of juvenile black carp fed test diets for 8 weeks

表4 青魚魚種攝食不同飼料8周后的腸和肝胰臟消化酶活性Tab. 4 Intestine and hepato-pancreas digestive enzyme activity of juvenile black carp fed test diets for 8 weeks

2.3 全魚體組成

青魚魚種攝食不同飼料8周后的全魚體組成分析結(jié)果(表5)。從表中可見, 青魚魚種攝食添加不同劑量的枯草芽孢桿菌的飼料與攝食不添加枯草芽孢桿菌的飼料相比, 其全魚水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

在飼料中添加一定劑量的枯草芽孢桿菌后, 能促進(jìn)幼魚、蝦生長已有一定的報(bào)道。15 g的印度鯉(Labeo rohita)攝食添加0.5×107—1.5×107cfu/g的枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料2周后魚體增重明顯高于對照組[3]。65 g的尼羅羅非魚(Oreochriomis niloticus)攝食添加1×107cfu/g的枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料1個(gè)月和2個(gè)月后魚體增重均高于對照組[4]。7.82 g的大黃魚(Larimichthys crocea)攝食添加1.35×107cfu/g的枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料10周后特定生長率顯著高于對照組[5]。2.11 g 的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) 攝食添加1×104—5×104cfu/g的枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料40d后生長加快[6]。0.67 g的凡納濱對蝦攝食添加6×106—6×107cfu/g的枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料58d后生長加快[7]。34.5 g的奧尼羅非魚(O. niloticus×O. aureus)攝食添加3.0×108cfu/g的枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料56d后魚體增重率顯著高于對照組[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明, 青魚攝食添加2×106—5×108cfu/g枯草芽孢桿菌的飼料后生長加快, 與上述報(bào)道相同。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看, 在飼料中枯草芽孢桿菌添加最低劑量為2×106cfu/g時(shí)即表現(xiàn)出較好的促生長作用, 而且提高添加劑量并不能使魚的生長進(jìn)一步改善, 但更低的添加劑量是否也能促進(jìn)青魚生長仍有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

研究表明, 在飼料中添加枯草芽孢桿菌可以提高魚類消化酶的活性。翹嘴鲌、異育銀鯽和日本沼蝦攝食添加2×107cfu/g枯草芽孢桿菌的飼料后, 腸蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性均有所提高[2]。在本實(shí)驗(yàn)中, 青魚攝食添加枯草芽孢桿菌的飼料后腸蛋白酶和淀粉酶的活性均顯著提高, 與上述的結(jié)果類似, 但腸脂肪酶活性并未見提高, 與之略有不同。這種差異可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件不盡相同所致。在對芽孢桿菌屬的其他菌株研究中, 不同研究者所報(bào)告飼用含不同菌株或用不同養(yǎng)殖品種作試驗(yàn)對象, 對不同消化酶活性的影響程度也不完全一致。劉波等[13]報(bào)道攝食添加4×107—6×107cfu/g的地衣芽孢桿菌的飼料后, 異育銀鯽腸道組織蛋白酶活性顯著提高。Wang & Xu報(bào)道[14], 在基礎(chǔ)飼料中添加1×107cfu/g的芽孢桿菌(Bacillus spp.)飼養(yǎng)6.5 g的鯉魚(Cyprinus carpio) 60d, 腸蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶均顯著提高。付天璽等[15]報(bào)道, 用添加1×108—6×108cfu/g的凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)的飼料, 飼養(yǎng)34.5 g的奧尼羅非魚胃和腸蛋白酶均顯著提高, 而對胃和腸的淀粉酶和脂肪酶無影響。江永明等[8]也報(bào)道攝食添加3.0×108cfu/g的枯草芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)飼料后, 奧尼羅非魚腸道、肝胰臟和胃蛋白酶活性顯著提高, 而對腸道、肝胰臟及胃的淀粉酶和脂肪酶沒有影響。

在有關(guān)飼料中添加芽孢桿菌對魚體成分的影響在不同的研究得到的結(jié)論并不一致。在本實(shí)驗(yàn)中青魚的全魚營養(yǎng)組成不受飼料中添加的枯草芽孢桿菌影響, 與Merrifield, et al.[16]報(bào)道69 g的虹鱒魚在攝食添加107.75cfu/g的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合菌的飼料10周后胴體成分不受影響的結(jié)果相一致。但其他的兩項(xiàng)研究卻有不同的觀察。王彥波[17]認(rèn)為在基礎(chǔ)飼料中添加5×106—1×107cfu/g的凝結(jié)芽孢桿菌, 飼養(yǎng)34.1 g的羅非魚(Oreochriomis spp.)與不添加組相比其肌肉中粗脂肪含量顯著降低, 肌肉中粗蛋白、粗灰分和水分含量沒有顯著變化。Bagheri, et al.[18]報(bào)道虹鱒魚苗攝添加1.8×106—6.1×109cfu/g的芽孢桿菌的飼料2個(gè)月后胴體脂肪隨飼料中芽孢桿菌添加量的上升而不斷下降, 胴體蛋白和水分含量也受到一定程度的影響。這可能是因芽孢桿菌的菌株和劑量不同、養(yǎng)殖對象不同或生長階段不同而造成對魚體成分影響程度存在差異。

表5 青魚魚種攝食不同飼料8周后的全魚體組成Tab. 5 Whole fish body composition of juvenile black carp fed test diets for 8 weeks

綜上所述, 在本實(shí)驗(yàn)條件下, 青魚魚種飼料添加2×106—5×108cfu/g枯草芽孢桿菌, 能使腸蛋白酶和淀粉酶活性提高, 促進(jìn)魚體生長, 降低飼料系數(shù),但不影響全魚組成。

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EFFECT OF ADDING BACILLUS SUBTILIS TO DIETS ON GROWTH PERFORMANCE, DIGESTIVE ENZYMES ACTIVITY AND BODY COMPOSITION OF FINGERLING BLACK CARP (MYLOPHARYNGODON PICEUS)

SHEN Bin-Qian1, CHEN Jian-Ming1, GUO Jian-Lin1, PAN Qian1, SUN Li-Hui1and YE Jin-Yun2
(1. Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China; 2. Huzhou Teachers Collage, Huzhou 313001, China)

A basal diet without adding Bacillus subtilis and four test diets containing 2×106, 2×107, 2×108and 5×108cfu/g of the B. subtilis were prepared to feed five groups of fish in triplicate with an initial average body weight of (4.16±0.03) g respectively. The feeding experiment was conducted in 15 re-circulating tank systems (80 L each) at a controlled water temperature of (25±0.5)℃ for eight weeks. The results showed that the weight gain of fish fed diets with B. subtilis increased significantly compared to that of fish fed the basal diet (P<0.05), and the feed conversion ratio(FCR) reduced significantly (P<0.05). However, weight gains and FCR of fish fed diets containing different levels of B. subtilis showed no significant difference (P>0.05). Survival rates were not affected by adding B. subtilis to diets (P>0.05). Intestine protease activities of fish fed diets with B. subtilis were higher than that of fish fed the basal diet (P<0.05), and intestine protease activity increased with the increasing level of B. subtilis supplement up to 2×107cfu/g, but above this level, it appeared to keep stable. The intestine amylase activity of fish fed diets with B. subtilis increased significantly (P < 0.05), and higher level of B. subtilis supplementing appeared to have higher activity. Fish fed diets with 2×107, 2×108and 5×108cfu/g B. subtilis had higher hepato-pancreas protease activities than those of fish fed the basal diet and a diet with 2×106cfu/g of B. subtilis. While the hepato-pancreas amylase activity, hepato-pancreas and intestine lipase activity were not affected significantly by dietary adding of B. subtilis (P>0.05), the body composition was not affected either. In conclusion, under the condition of this experiment, adding 2×106—5×108cfu/g B. subtilis to fingerling black carp diet could improve fish growth and feed conversion without affecting the body composition.

Bacillus subtilis; Black carp (Mylopharyngodon piceus); Growth; Digestive enzyme activity; Body composition

S963.73

A

1000-3207(2013)01-0048-06

10.7541/2013.48

2011-11-14;

2012-10-19

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系專項(xiàng)(CARS-46-21); 湖州市水產(chǎn)養(yǎng)殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(2010KC02)資助

沈斌乾(1983—), 男, 浙江湖州人; 農(nóng)學(xué)學(xué)士; 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖與魚類飼料營養(yǎng)研究。E-mail: alsbq7@163.com

陳建明(1965—), 男, 浙江湖州人; 農(nóng)學(xué)學(xué)士; 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖與魚類飼料營養(yǎng)研究。E-mail: aqua_labjm@yahoo.com.cn