巨修練，王黎麗，李 科

(武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種中央神經系統(tǒng)(CNS)抑制性神經遞質，它的傳遞作用是由GABA受體介導的.人的許多神經性疾病都與GABA受體有關，包括帕金森氏癥、失眠、精神分裂癥等，同時，GABA受體也是硫丹、六六六等有機氯類、氟蟲腈及安維菌素類等殺蟲劑的重要作用靶標.因此GABA受體一直為人們所關注.

哺乳動物GABA受體根據其結構和藥理作用的不同可以分為兩類，一類為離子型受體，另一類為代謝型受體.GABAA受體是離子型受體，存在于哺乳動物的CNS和脊椎，并與一個內在的氯離子通道相耦聯(lián).GABAB受體是代謝型受體，通過G蛋白與第二信使耦聯(lián)，在神經末端引起GABA流量的下降，可出現(xiàn)前突出抑制，從而引起神經遞質釋放下降[1-3].GABAC受體也是離子型受體，是由β亞基組成的同源多聚體，主要分布于脊椎動物的視網膜.對GABAC受體的功能特性了解不多，近年將ρ受體亞單位組成的GABAC受體歸為GABAA受體.GABAA受體是3種亞型中最重要的一種[3-4].

GABAA受體為五聚體，是配體門控離子通道受體超家族的一個成員，該家族還包括nAChR、甘氨酸受體(strychnine-sensitive glycine receptor)和5-HT3受體(serotonergic 5-HT3receptor).通過cDNA克隆和基因組技術已鑒定了21個哺乳動物大腦中GABAA受體亞基，依據氨基酸順序相似程度，將亞基系列分為α1-6，β1-4，γ1-3，δ ，ε ，π ，ρ1-3，θ 8個亞基族[1-5].不同亞基族間氨基酸序列的同源性約為20%～40%，而同一亞基族間的同源性高達60%～80%.GABAA受體的每個亞基由400～550個氨基酸殘基組成，包括三個區(qū)域：約220個氨基酸殘基組成的胞外N端疏水域；4個疏水的跨膜螺旋順序(Ml-M4)構成的跨膜區(qū)域，每個跨膜序列長度為22個氨基酸殘基，其中M2形成氯離子通道，能選擇性地通過帶負電荷的氯離子；處于細胞內基質的環(huán)，對這部分的結構和功能研究較少[2-6].

GABAA受體可由不同的亞基按不同方式組合，但不是所有的亞基都能彼此有效地組裝成功能性受體.研究表明，存在于哺乳動物大腦中的天然GABAA受體主要由α，β，γ亞基組成，常見的亞型組合式有α2β3γ2，α1β2γ2和α3β3γ2[5-8].

哺乳動物GABAA受體存在多個與配體結合的活性位點，已發(fā)現(xiàn)的GABA受體與配體的結合點有五個：GABA位點、巴比士鹽酸(Barbiturate)位點、苦毒寧(Picrotoxinin)位點、苯二氮卓(Benzodiazepine)位點及類固醇類(Steroid)位點.每個結合位點與藥物分子結合產生的藥理作用不同.例如作用于GABA結合位點的藥物，可開啟Cl-通道，使Cl-內流而導致細胞內電位增加，進而產生超極化抑制神經興奮性.作用于Barbiturate結合位點的藥物，可增加GABA活化Cl-通道的通透性，表現(xiàn)出明顯的麻醉效應.Picrotoxinin 位點是GABAA受體非競爭性的抑制結合位點，主要起關閉Cl-通道、阻斷GABA受體的作用.而與Benzodiazepine位點結合的藥物，可增加Cl-通道開放的頻率，使Cl-通道開放時間延長，產生抑制作用，從而產生鎮(zhèn)靜、催眠及抗驚厥現(xiàn)象.神經活性甾類化合物與Steroid位點結合，可選擇性的調節(jié)GABAA受體機能[9-14].GABA受體不同結合位點產生的藥理作用不同，對開發(fā)高選擇性低毒性的藥物分子有重大意義.

昆蟲GABA受體的研究遠落后于哺乳動物GABAA受體的研究.僅有幾種類型的配體門控氯離子通道的亞基已在昆蟲中鑒定，其中包括黑腹果蠅和煙蚜夜蠅的RDL、黑腹果蠅中的GRD和LCCh3.RDL是抗狄氏劑(resistance to dieldrin)的同系物；GRD是GABA和甘氨酸樣受體(GABA and glycine-like receptor of D. Melanogaster，GRD)；LCCh3是配體門控氯離子通道同系物3(ligand-gate chloride channel homologue 3)[5].

作用于GABA受體的藥物分子氟蟲腈((R,S)-5-氨基-1-(2,6-二氯-4a-三氟甲基苯基)-4-三氟甲基亞磺酰基吡唑-3-腈)是GABA-氯離子通道抑制劑，可以和GABA受體結合，干擾氯離子通道，進而導致神經信號的損失，進而死亡，是一種重要的殺蟲劑.但對于某些非靶標生物水生生物卻有很高的毒性，因此，本實驗通過計算機輔助手段對斑馬魚GABA受體與氟蟲腈及其衍生分子的對接模擬，從理論上解釋氟蟲腈對斑馬魚產生毒性的原因[15-18].

1 實驗部分

本實驗中所有計算工作都是基于windows平臺的sybyl8.0軟件(Tripos Inc.)而完成的，除特別介紹外，所有參數(shù)均采用默認值.

1.1 同源模建

1.1.1 序列的選擇 為了構建斑馬魚GABA受體，首先從Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據庫獲得斑馬魚GABAA受體ρ亞基的序列：Q5RIM2.然后對這些亞基進行編輯，刪去無需構建結構的膜外配體結合區(qū)域和膜內環(huán)區(qū)的氨基酸序列.

1.1.2 模板的選擇 模板的選擇在同源模建中起關鍵作用，直接決定了靶結構的折疊與質量.在本實驗中，選用秀麗隱桿線蟲谷氨酸門控離子通道受體跨膜段作為模板，PDB數(shù)據庫編號為3RHW，然后對模板進行編輯，刪去膜外區(qū)和膜內區(qū)，這樣就得到跨膜段的模板.

1.1.3 構建亞基 首先將靶序列與模板序列進行比對(sequence alignment)，采用Needleman&Wunsch 方法，得到一個多序列比對文件(multiple sequence format，MSF).接下來將MSF文件導入到ORCHESTRAR模塊中，可以使模板的序列與三維結構對應起來，然后采用BATON方法將模板結構和靶序列進行結構比對.最后就可以構建出靶肽鏈的結構，包括識別結構保守區(qū)域(structure conserved regions，SCR)，搜索環(huán)區(qū)和添加側鏈.

1.1.4 模型的組合 需要將構建的斑馬魚的GABAA受體跨膜段的各個亞基一一對應疊合到模板上.再使用MERGE模塊合成一個五聚體斑馬魚ρ5 GABAA受體跨膜段.

1.1.5 模型的優(yōu)化與修正 采用分子力學和分子動力學的方法對斑馬魚GABA受體跨膜段的模型進行修正.在AMBER7 FF99立場下，首先將整個體系進行共軛梯度法優(yōu)化至能量梯度的RMS小于5 kcal/mol/nm，此外采用分子動力學(molecular dynamics，MD)的方法來優(yōu)化模型，以檢驗模型是否具有穩(wěn)定的構象，在300 K的恒溫條件下，計算總長為500 ps，步長1fs.

1.2 分子對接

分子對接方法關鍵在于定義正確的受體結合口袋.由于目前并未獲得GABA受體的三維結構，更沒有復合物的任何報道，所以配體的對接采用殘基模式來定義結合口袋，即指定一些氨基酸殘基，設定其周圍一定范圍內的氨基酸殘基為活性位點.在分子對接(Surflex-docking)模塊下，活性位點被稱為原型分子(protomol).另外，有兩個參數(shù)可以設置原型分子的形狀與大小:Threshold設置原型分子的大小；Bloat值設置原型分子滲入蛋白空隙的程度.

試驗中選擇了一系列苯基吡唑類化合物，通過將這些化合物與斑馬魚GABAA受體跨膜段分子對接，確定對接中的優(yōu)勢構象和產生結合效應的基團.

通過Surflex-docking 模塊進行分子對接后，Csorce模塊會對每一個配體的對接結果進行打分，包括D-score、PMF-score、G-score、Chemscore這四個函數(shù).打分函數(shù)基于受體-配體復合物的結合親和力，將會考慮疏水、極性、排斥、熵、溶劑化作用.最后，可以根據以下函數(shù)換算得到受體與配體的結合自由能(kcal/mol)：Free Energy of Binding=RTlnKd[19-20].

2 結果與討論

2.1 同源模建

斑馬魚的序列與模板序列比對的結果見圖1，3RHW為同源五聚體，僅比對一條鏈即可，從圖1中可知，受體通道部分保守區(qū)域序列的同源性很高，目標序列與模板序列的整體一致度在表1中給出，從表1中可知，整體同源性高達37.5%，當要構建的蛋白質序列與模板序列同源性達到30%時，構建蛋白質一級結構的相似性可達到80%.因而所選的模板是合理的.

圖1 序列比對結果Fig.1 Result of sequence alignment

目標序列模板序列(所有亞基均來自線蟲谷氨酸受體的亞基)TaTbTcTdTe與斑馬魚GABAR亞基一致性/%37．537．537．837．537．5

經過序列比對、搜索保守區(qū)域、構建環(huán)區(qū)、添加側鏈、能量優(yōu)化后，得到了斑馬魚的各亞基.最終斑馬魚GABAA受體通道區(qū)結構見圖2，從圖2中可清晰的觀察到斑馬魚GABAA受體跨膜段是五聚體，TM2組成離子通道.

圖2 斑馬魚GABAA受體跨膜段三維結構Fig.2 Three-dimensional(3D) molecular structure of the TMD of zebrafish GABAA receptor

為了驗證模型的準確性，對構建的斑馬魚GABAA受體跨膜段進行一系列的能量優(yōu)化和結構修正.利用sybyl軟件的Dynamics模塊進行分子動力學能量優(yōu)化后，能量-時間圖見圖3，斑馬魚的GABAA受體跨膜段模型在開始的150 ps里能量有較大的降低，在隨后的350 ps里能量趨于穩(wěn)定.經過分子動力學能量驗證發(fā)現(xiàn)，模型是穩(wěn)定可靠的.

圖3 斑馬魚GABAA受體跨膜段500 ps分子動力學計算能量-時間圖Fig.3 Potential energy with respect to simulation time for 500 ps molecular dynamics on the zebrafish GABAA receptor

實驗中還運用ProTable模塊對模型的立體化學性質進行驗證.在斑馬魚的GABAA受體跨膜段的拉氏構象圖4中，可發(fā)現(xiàn)大量的氨基酸殘基聚集在值-60、-45度處，這恰恰與模型具有大量α螺旋結構的特點吻合.因為根據氨基酸殘基構象的統(tǒng)計結果，構成α螺旋結構的氨基酸殘基正好處于拉氏構想圖這一區(qū)域.通過計算，斑馬魚的GABAA受體模型中99.7%的氨基酸殘基處于一般允許區(qū)域或者最大允許區(qū)域.通過拉氏構象圖驗證，可以進一步確定模型的合理性.因此在實驗中通過同源模建構建得到的GABAA受體跨膜段是可以作為后面實驗中分子對接所采用的模型[16].

2.2 分子對接

氟蟲腈是一種苯基吡唑類殺蟲劑，殺蟲廣譜，對害蟲以胃毒作用為主，兼有觸殺和一定的內吸作用，其殺蟲機制在于阻滯昆蟲GABA受體，是一個比較典型的殺蟲劑，具有一個獨特的優(yōu)點即不同的生物物種對其表現(xiàn)出不同的選擇性.它對蚜蟲、葉蟬、蠅類等重要害蟲有很高的殺蟲活性，但隨著氟蟲腈的大量使用，它對水生生物毒性大的弊端暴露出來.因此，研究氟蟲腈及其衍生物與水生生物斑馬魚GABAA受體的對接模式，以期從分子角度解釋氟蟲腈對水生生物產生毒性的原因.

通過對氟蟲腈不同基團的取代，得到下列氟蟲腈衍生物，將氟蟲腈及其衍生物與斑馬魚GABAA受體跨膜區(qū)作用位點對接，對接打分及氫鍵個數(shù)如表2所示.

圖4 斑馬魚GABAA受體跨膜段氨基酸Ramachandran圖Fig.4 φ-ψ Graph of the backbone of zebrafish GABAA receptor

通過對接比較分析可知，苯基上R1、R2、R3、R5分別被CF3,Cl，Cl，SOCF3或SO2CF3取代時,化合物與斑馬魚GABAA受體跨膜段結合較好.說明這些基團是產生作用必不可少的基團.通過在一組對接實驗，找到在對斑馬魚GABAA受體跨膜段對接中起關鍵作用的基團.在此基礎上，在NCI-2000數(shù)據庫中基于氟蟲腈結構相似性80%篩選出以下化合物，見圖5，將以下化合物分別與斑馬魚GABAA受體對接，得到結果如圖5所示.

化合物結構編號R1R2R3R4R5R6與斑馬魚GABAA受體對接打分氫鍵數(shù)/個結合自由能/(kcal/mol)1ClCF3ClCNSOCF3NH24．353-5．792ClCF3ClHSOCF3NH24．254-5．673ClCF3ClCNSOCF3H4．034-5．534ClCF3ClCNHNH23．033-4．155ClCF3ClCNSO2CF3NH25．324-6．786ClCF3ClCNSCF3NH23．153-4．227HCF3ClCNSOCF3NH23．124-4．228HCF3HCNSOCF3NH23．843-4．899HHClCNSOCF3NH22．742-3．54續(xù)表2 苯基吡唑類化合物結構與斑馬魚GABAA受體跨膜段的對接結果Table2 StructuresofphenylpyrazolederivatesanddockingresultwithzebrafishGABAArceptor10HCF3ClHSOCF3NH23．983-5．2411HCF3ClCNSOCF3H3．483-4．6612HCF3ClCNHNH23．273-4．1313HCF3ClCNSCF3NH23．763-4．7514HCF3ClCNSO2CF3NH23．154-4．2215ClHClCNHNH22．511-3．4216ClHClCNSCF3NH21．980-3．2317ClHClCNSO2CF3NH22．152-3．3318ClHClHSOCF3NH21．750-2．8619ClHClCNSOCF3H2．541-3．4220ClCF3ClHSOCF3H4．442-5．8621ClCF3ClHHNH24．452-5．8622ClCF3ClHSO2CF3NH24．684-6．0523ClCF3ClHSCF3NH24．323-5．8024ClCF3ClCNHH4．082-5．5325ClCF3ClCNSO2CF3H4．315-5．7926ClCF3ClCNSCF3H4．903-6．4527HHHCNSOCF3NH21．492-2．7828HCF3HCNSOCF3H3．722-4．7929HCF3HHSOCF3NH23．563-4．6230HCF3HCNHNH23．962-5．5031HCF3HCNSCF3NH23．073-4．6532HCF3HCNSO2CF3NH23．214-4．3233HCF3ClHSOCF3H3．214-4．3234HCF3ClHHNH22．421-3．3135HCF3ClHSO2CF3NH24．365-5．8036HCF3ClHSCF3NH23．833-4．7537HCF3ClCNHH3．462-4．6638HCF3ClCNSO2CF3H4．015-5．53

39HCF3ClCNSCF3H4．902-6．4540ClHClHSOCF3H2．261-3．2741ClHClHHNH22．230-3．2742ClHClHSCF3NH23．060-4．6543ClHClHSO2CF3NH22．282-3．2744ClHClCNHH2．960-3．9445ClHClCNSCF3H2．910-3．9446ClHClCNSO2CF3H3．902-5．30

圖5 氟蟲腈及其虛擬篩選的化合物結構Fig.5 Structures of fipronil and its analogues by virtual sereening

利用surflex-docking將氟蟲腈及其虛擬篩選的化合物對接至斑馬魚GABAA受體的結合口袋，在表3中，列出了對接的打分，結合自由能及氫鍵的個數(shù)，將表3中的對接結果與氟蟲腈和斑馬魚對接的結果進行比較，經過對一系列化合物對接模式、結合氫鍵、綜合打分等進行分析，可以將化合物分為兩組，一組為化合物1，47～59，另一組為60～71：

表3 斑馬魚GABAA受體與氟蟲腈及其衍生物對接結果Table 3 Docking results of zebrafish GABAA receptor with fipronil and its derivatives

a.在第一組化合物中，從氟蟲腈和斑馬魚GABAA受體對接模式，可以解釋氟蟲腈對斑馬魚的毒性，通過觀察其他化合物，發(fā)現(xiàn)評分較高的化合物1，47～59都具有相似的結合模式.氟蟲腈垂直地定位于TM2的胞質端，兩個亞基即鏈C和D構成了主要的結合口袋.這與之前研究的氟蟲腈與家蠅GABAA受體對接的模式相同.另外在圖6中可觀察到，斑馬魚GABAA受體與氟蟲腈對接中，斑馬魚GABAA受體的C/ARG38側鏈為氰基的氮原子提供氫鍵；D/ASN28為氨基的氮原子提供氫鍵，與化合物47～59的對接中，吡唑環(huán)上3位氰基氮原子以及苯甲基氟原子作為氫鍵受體.

圖6 化合物1氟蟲腈與斑馬魚GABAA受體對接模式Fig.6 Docking mode of the fipronil with Zebrafish GABAA receptor

圖7 化合物68與斑馬魚GABAA受體對接模式Fig.7 Docking mode of the compound 68 with Zebrafish GABAA receptor

b.第二組化合物與斑馬魚GABAA受體對接評分較低，,一是與第一組化合物比較它們的分子體積較小，因而對接模式與第一組化合物不同，它們不是垂直定位于離子通道，而是橫向定位于離子通道，以這種模式對接時，受體與藥物分子間作用力較弱，第二組化合物對斑馬魚不產生毒性.圖7中斑馬魚GABAA受體與化合物68對接，斑馬魚GABAA受體的C/THR35和E/THR35側鏈為三氟甲基上的氟原子和氰基的氮原子提供氫鍵；A/ASN28為氨基的氮原子提供氫鍵.從自由結合能上也進一步得到驗證[21-22].這一組對接實驗驗證了苯基吡唑類化合物與斑馬魚GABAA受體對接的最優(yōu)模式.兩組對接實驗共同解釋了氟蟲腈對斑馬魚GABAA受體的對接結合機理.

表4顯示了氟蟲腈與斑馬魚GABAA受體對接產生的氫鍵，氫鍵作用分析確定了在亞基TM2區(qū)域C/ARG38和D/ASN28產生關鍵作用，在斑馬魚GABAA受體與其它氟蟲腈衍生物對接過程中，氫鍵也都是產生于ARG38 和ASN28這兩個氨基酸殘基.

表4 斑馬魚GABAA受體與氟蟲睛形成的氫鍵距離和角度Table 4 Distance and angle of H-bonds formed between zebrafish GABAA receptor and fipronil

在分子對接時，每個配體會產生一系列不同構象與受體結合，并且對每種對接模式進行打分評價，打分排在前10位的構象被保存.從表5可以知道，10個不同構象氟蟲腈分子與斑馬魚GABAA受體結合時，對接總打分值較高，D打分、PMF打分、G打分、化學打分這四個打分函數(shù)計算的結合能量較低，10個構象的各個打分都比較穩(wěn)定，這說明在能量上看，氟蟲腈和斑馬魚GABAA受體結合穩(wěn)定，因而氟蟲腈對斑馬魚產生毒性.

表5 10個不同構想氟蟲睛與斑馬魚GABAA受體對接結果Table 5 Docking result of 10 different conformations of fipronil with zebrafish GABAA receptor

3 結 語

本研究通過同源模建構建了斑馬魚GABAA受體跨膜通道區(qū)的三維結構，通過能量優(yōu)化和動力學優(yōu)化確定了所構建的模型的穩(wěn)定性和可靠性，進一步利用構建的模型與氟蟲腈及其衍生物進行分子對接，通過對對接結果的分析，得知當苯環(huán)上R1、R2、R3分別被Cl,CF3和Cl取代時，吡唑環(huán)上R5被SOCF3或SO2CF3取代時，化合物與斑馬魚GABAA受體結合穩(wěn)定，即分子對斑馬魚可能產生毒性.當分子體積較大時，化合物1，47～59垂直地定位于TM2的胞質端，這種結合模式更穩(wěn)定，而分子體積相對較小的化合物60～71則橫向定位于離子通道結合模式也相對不穩(wěn)定，因而氟蟲腈衍生物對斑馬魚產生毒性的一個重要原因是分子體積應該足夠大.

綜上所述，在對氟蟲腈分子的進一步研究中，可以從分子體積大小與苯環(huán)和吡唑換上的取代基基上做一些改變，從而開發(fā)出對害蟲高選擇性，而對其他水生生物低毒的殺蟲劑.

致謝

感謝武漢工程大學化工與制藥學院為本實驗提供的研究平臺！

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