周曉穗，陳佳林，張 梅，王方海

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥昆蟲學(xué)研究所, 廣東 廣州 510275)

甲基化敏感性代表性差異分析方法(MS-RDA)由Ushijima等[1]于1997年建立，即通過將甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化處理樣品基因組的方法和代表性差異分析方法結(jié)合起來，優(yōu)化檢測子與驅(qū)趕子比例，從而檢測甲基化差異區(qū)域片段的一種方法。該方法適用于特異、低豐度基因組DNA甲基化的篩查與鑒定，在疾病發(fā)生、機(jī)體發(fā)育、相關(guān)病原株系DNA甲基化差異分析以及新遺傳標(biāo)記的分離等方面顯示出較大潛力。在高等動物[2-3]、植物[4]上已大量應(yīng)用，但在昆蟲上尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用該方法的報道。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式，早在果蠅、蚜蟲、家蠶、甘藍(lán)夜蛾、粉蚧等昆蟲中均已發(fā)現(xiàn)基因組中存在DNA甲基化現(xiàn)象[5-6]。在螞蟻基因組中也已發(fā)現(xiàn)存在DNA甲基化這種表觀遺傳修飾[7]，Bonasio 等[8]2012年發(fā)表在Current Biology的論文進(jìn)一步闡明螞蟻不同種屬間在DNA甲基化譜上存在一定的差異。最近Patalano等[9]在Current Opinion in Cell Biology上撰文指出社會性昆蟲的多型現(xiàn)象與表觀遺傳修飾、特別是DNA甲基化相關(guān)。這些都說明昆蟲中也存在大量甲基化現(xiàn)象，在調(diào)控昆蟲生長發(fā)育和多型性等方面應(yīng)發(fā)揮著一定的調(diào)控作用。

白背飛虱Sogatellafurcifera(Horvath)體型小，易遷飛，繁殖力強(qiáng)，是水稻的重要蟲害之一。其成蟲有長翅型、短翅型兩種類型。長翅型為遷飛型，具有遠(yuǎn)距離遷飛的能力；短翅型屬于定居繁殖型，產(chǎn)卵期長且產(chǎn)卵量大。長、短翅型比率發(fā)生動態(tài)是預(yù)測稻飛虱數(shù)量的一個重要參數(shù)[10-11]。研究稻飛虱性別分化和繁殖機(jī)理及翅行分化是近幾年的研究熱點(diǎn)，將有助于探索新的方法控制該種害蟲的危害。

已有研究表明，白背飛虱的翅型分化在發(fā)育過程中并未牽涉到基因組的改變，而是涉及到基因表達(dá)的可遺傳改變，屬于典型的表觀遺傳現(xiàn)象，據(jù)此推測，在稻飛虱翅型分化過程中可能存在DNA甲基化修飾現(xiàn)象。我們具體測定了長、短翅型白背飛虱成蟲中DNA甲基化情況，發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在DNA甲基化現(xiàn)象。本研究重點(diǎn)對MS-RDA方法進(jìn)行改進(jìn)，并用白背飛虱為材料，對雌雄性別和長短翅型個體分別進(jìn)行了DNA甲基化差異片段篩選，結(jié)果成功篩選到與雌雄性別或長短翅型相關(guān)聯(lián)的特異DNA甲基化差異片段，為今后進(jìn)一步從DNA甲基化的角度探討性別分化和翅型轉(zhuǎn)換的機(jī)理打下良好的基礎(chǔ)，同時也為今后在其它昆蟲中應(yīng)用MS-RDA方法提供一定的借鑒和指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx

稻縱卷葉螟采自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田內(nèi)。挑選部分雌雄成蟲及長翅型和短翅型成蟲為供試?yán)ハx。

1.2 基因組DNA的提取

分別選取白背飛虱長翅型雄成蟲、長翅型雌成蟲和短翅型雌成蟲各10頭,分別加入適量的緩沖液后用微型玻璃勻漿器勻漿抽提DNA，具體方法參照TaKaRa公司的基因組DNA提取試劑盒的方法和步驟。

1.3 基因組DNA的酶切

選取每樣品基因組DNA 2 μg，加入1.5 μL的甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶 Hpa Ⅱ(TaKaRa公司)，混勻后在37 ℃下酶切 20 h，隨后在66 ℃的恒溫下處理 30 min 使酶滅活，未甲基化的 CCGG 位點(diǎn)被切割成黏性末端, 而甲基化的位點(diǎn)則未被切割。

1.4 接頭的配制

共合成了6個單鏈序列(見表1)，分別將這些單鏈序列DNA配制成濃度為 500 pmol/μL的溶液，將互補(bǔ)的單鏈序列分別取 100 μL配對混勻后于56 ℃孵育 2 min, 然后以每 2 min遞降2 ℃的速度逐步冷卻到10 ℃,使其自身退火形成如下3個接頭：RHpaⅡ24/11、JHpaⅡ24/11、NHpaⅡ24/11，備用。

表1 MS-RDA方法中所使用的接頭序列

1.5 擴(kuò)增子的制備

將上述酶切產(chǎn)物兩端加入RHpaⅡ24/11接頭，在T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)作用下, 16℃下連接 15 h，采用DNA片段純化試劑盒(TaKaRa公司)純化連接產(chǎn)物。取部分連接產(chǎn)物作為模板, 以接頭中的RHpaⅡ24為引物，在LATaq酶(TaKaRa公司)作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使連接有R接頭的DNA片段即擴(kuò)增子得到有效富集。w=1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增子。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃變性 1 min，72 ℃退火 2 min，28個循環(huán)后，72 ℃延伸 10 min。

1.6 消減雜交

將各樣品的擴(kuò)增子在甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶HpaⅡ酶切作用下除去R接頭，酶切產(chǎn)物用DNA片段純化試劑盒純化。分別將白背飛虱長翅型雄成蟲和短翅型雌成蟲擴(kuò)增子去R接頭純化后的產(chǎn)物連上JHpaⅡ24/11接頭，作為檢測子，采用長翅型雌成蟲擴(kuò)增子去R接頭純化后的產(chǎn)物作為驅(qū)趕子進(jìn)行的雜交稱為正交，反之叫做反交。檢測子和驅(qū)趕子按1∶40的比例混合溶于 4 μL的雜交緩沖液，96 ℃變性 10 min，67 ℃雜交 23 h。雜交反應(yīng)完成后，用雜交產(chǎn)物為模板，以JHpaⅡ24為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。17個循環(huán)后加入Mung Bean Nuclease(TaKaRa公司)消化單鏈核苷酸，消化產(chǎn)物經(jīng)DNA片段純化試劑盒純化后繼續(xù)PCR反應(yīng)30個循環(huán)，使檢測子中靶序列得到大量擴(kuò)增。w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。將上述第1輪正交和反交的產(chǎn)物分別用HpaⅡ酶消化除去J接頭，經(jīng)DNA片段純化試劑盒純化后換上N接頭，隨后進(jìn)行第2輪雜交和擴(kuò)增，根據(jù)具體情況檢測子和驅(qū)趕子由第一輪的1∶40改為1∶400到1∶10 000之間。

1.7 克隆、測序及相似性分析

將最終得到的消減雜交產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TaKaRa公司)回收后，與pGEM-T載體(Promega公司)在4 ℃下連接12 h，將連接產(chǎn)物加入JM109感受態(tài)細(xì)菌(Fermentas公司制備)進(jìn)行轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng) 14 h，挑取陽性克隆，培養(yǎng)擴(kuò)增后，取部分菌液送TaKaRa公司測序，所測得的序列經(jīng)BLAST比對進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS-RDA方法的改進(jìn)

MS-RDA方法最早由Ushijima等[1]于1997年建立，該方法主要包括DNA提取、酶切、擴(kuò)增子制備和消減雜交等幾大步驟。我們參照了Ushijima等的方法，進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，使其適用于體型很小的昆蟲，并用白背飛虱具體進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，取得了與性別或長短翅型相關(guān)聯(lián)的甲基化差異顯示DNA片段(詳見后2部分的描述)，結(jié)果比較理想。我們的方法主要在如下4個方面進(jìn)行了改進(jìn)(見表2)：①樣品DNA的提取，原方法采用了比較經(jīng)典的苯酚一氯仿抽提法，而我們采用了Takara基因組純化試劑盒，提取時間大為縮短，且獲得的基因組DNA純度較高；②酶切時基因組DNA用量從原方法的20 μg減少到2 μg，這樣不但可以減少酶的用量，節(jié)約成本，且非常適合體形較小、難以收集大量樣本材料的多數(shù)昆蟲；③擴(kuò)增子制備時的PCR比原先增加了3個循環(huán)，這樣解決了起初模板量較低的問題；④消減雜交從原先的3輪降為2輪，若第2輪時，使用1∶400的比例，未能出現(xiàn)清晰條帶，而是彌散條帶的話，根據(jù)具體結(jié)果，再改為1∶4 000或更高的比例重新進(jìn)行，這樣就不需要繁瑣的第3輪消減雜交過程，使整個方法變得相對簡單、更易實(shí)施。

表2 MS-RDA方法被改進(jìn)的4個方面

2.2 白背飛虱長翅型雄成蟲和長翅型雌成蟲甲基化差異DNA片段

將白背飛虱長翅型雄成蟲作為檢測子，長翅型雌成蟲作為驅(qū)趕子，經(jīng)過2輪的正交反應(yīng)后得到1條 200 bp左右的清晰的差異性條帶。以長翅型雌成蟲作為檢測子，長翅型雄成蟲作為驅(qū)趕子，經(jīng)過兩輪的反交后則得到可見的3條清晰明亮的差異性條帶，大小分別為250，400，450 bp左右(見圖1)。這些甲基化差異性DNA片段經(jīng) pGEM-T載體克隆測序后，核苷酸序列分別為207、260、396、462 bp，去掉接頭序列后則分別為169、212、347、414 bp(見表3)。后3個序列已被GenBank收錄，登錄號分別為： JX847621、JX624161、JX472453。經(jīng)BLAST比對分析后，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量為414的片斷序列與白背飛虱28S核糖體RNA基因高度相似，相似度達(dá)99%，因此推斷該序列就是白背飛虱28S核糖體RNA基因的部分序列。而其余3個序列未發(fā)現(xiàn)相似性序列存在，應(yīng)屬于未發(fā)現(xiàn)的新基因，其具體功能等方面還有待進(jìn)一步研究。

圖1 兩輪消減雜交后的電泳圖Fig.1 Two electrophoretogram after the second cycle of competitive hybridizationM：DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：雄成蟲作為檢測子，雌成蟲作為驅(qū)趕子；2：雌成蟲作為檢測子，雄成蟲作為驅(qū)趕子；3：短翅型雌成蟲作為檢測子，長翅型雌成蟲作為驅(qū)趕子；4：長翅型雌成蟲作為檢測子，短翅型雌成蟲作為驅(qū)趕子

DNA片段大小/bpGenBank登記號序列比對結(jié)果169無無相似序列212JX847621無相似序列347JX624161無相似序列414JX472453與白背飛虱28S核糖體RNA基因高度相似

2.3 白背飛虱短翅型雌成蟲和長翅型雌成蟲甲基化差異DNA片斷

將白背飛虱短翅型雌成蟲作為檢測子，長翅型雌成蟲作為驅(qū)趕子，經(jīng)過2輪的正交反應(yīng)后得到1條相對分子質(zhì)量略大于500 bp 的差異性條帶。以長翅型雌成蟲作為檢測子，短翅型雌成蟲作為驅(qū)趕子，經(jīng)過兩輪的反交后則得到1條相對分子質(zhì)量500 bp 左右的差異性條帶(見圖1)。分別對這2條差異性條帶進(jìn)行切膠純化回收，并用pGEM-T載體進(jìn)行克隆測序，測序后所得其大小分別為512、501到bp，去掉接頭序列后則分別為464、453 bp(見表4)。這2個序列均已被GenBank收錄，登錄號分別為：JX514031、JX472454。經(jīng)BLAST比對分析后，發(fā)現(xiàn)464 bp的片段序列與多種動物的18S核糖體高度相似，如與一種兩索屬動物Amphimermissp. A-2007的18S核糖體高達(dá)99%相似；與索科線蟲Mermithidae sp. TB-2009 的18S核糖體相似度達(dá)97%；與食蚊羅索線蟲Romanomermisculicivorax的18S核糖體相似度也達(dá)到了88%(圖2)。另一片段序列則與白背飛虱28S核糖體RNA基因部分序列高度相似，相似度達(dá)99%，因此該序列應(yīng)是白背飛虱28S核糖體RNA基因的部分序列。

表4 白背飛虱長、短翅型間的2個甲基化差異DNA片段Table 4 Two differentially methylated DNA sequences from long wing and brachypterism of Sogatella furcifera

圖2 長度464 bp的序列經(jīng)BLAST比對進(jìn)行相似性分析的部分截圖Fig.2 The partial screenshot of similarity analysis of the 464 bp sequence by BLAST

3 討 論

MS-RDA是用來檢測某些生物樣品間的甲基化差異區(qū)域片段的一種方法，特別適用于特異、低豐度基因組DNA甲基化的篩查與鑒定，在哺乳動物和植物研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式，在哺乳動物和植物上已有大量研究和報道[2-4]，然而，在昆蟲中關(guān)于甲基化的研究較晚，報道相對較少，主要集中于這幾年[6]，目前在昆蟲上尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MS-RDA方法的報道。為將MS-RDA方法應(yīng)用于體型較小的昆蟲，本研究對該方法進(jìn)行了如下改進(jìn)：采用試劑盒提取樣品DNA、降低被酶切時基因組DNA用量、增加擴(kuò)增子制備時的PCR循環(huán)數(shù)、將消減雜交降為2輪(具體見前面描述)。利用改進(jìn)后的方法，在白背飛虱中進(jìn)行了具體實(shí)驗(yàn)，成功獲得了與性別或長短翅型相關(guān)聯(lián)的清晰的甲基化差異顯示DNA片段，這為將來在其它昆蟲有關(guān)甲基化研究中應(yīng)用該方法提供了一定借鑒和指導(dǎo)價值。

本研究成功獲得4條與白背飛虱雌雄性別相關(guān)聯(lián)的甲基化差異顯示片段，其中有3個序列未發(fā)現(xiàn)同源性序列，屬于新基因，它們的具體功能還有待進(jìn)一步研究。這為今后從DNA甲基化的角度研究白背飛虱的性別分化打下了良好的開端。

同時我們還獲得了與白背飛虱長短翅型相關(guān)聯(lián)的2個基因條帶，1條與多種動物的18S核糖體高度相似，另一條與白背飛虱28S核糖體RNA基因序列同源，據(jù)此推測，白背飛虱的翅型分化可能與核糖體基因的某些位點(diǎn)的甲基化有關(guān)。

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