張 麗，周長(zhǎng)征

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

木芙蓉葉為錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥葉，其味微辛，性涼，歸肺、肝經(jīng)，具有清肺涼血、散熱解毒、消腫排膿等功效，臨床主要用于肺熱咳嗽、瘰疬等的治療[1]。本實(shí)驗(yàn)通過體外建立細(xì)胞感染模型試驗(yàn)和體內(nèi)感染小鼠試驗(yàn)來驗(yàn)證木芙蓉葉提取物具有抗病毒的藥理活性，以期為木芙蓉葉能開發(fā)成一種防治病毒的新藥提供藥效學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 木芙蓉HibiscusmutabilisL.葉購(gòu)于安徽濠州藥材市場(chǎng)，由周鳳琴教授鑒定。陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林針劑(100mg/mL，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)。

1.2 病毒 呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(Flu A)和副流感病毒(HPIVs)均引自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所。

1.3 細(xì)胞 HEK-293細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞系)購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。

1.4 試劑 MEN培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；新生小牛血清(杭州四季青公司)；胰酶(美國(guó)Gibco公司)；細(xì)胞維持液(含2%新生牛血清的MEN)；細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%新生小牛血清的MEN)；其他試劑均為分析純。

1.5 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司)；-80 ℃冰箱(美國(guó)Forma公司)；-20 ℃冰箱(中國(guó)青島得貝公司產(chǎn)品)；酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國(guó)上海鑫培儀器設(shè)備有限公司)。

1.6 動(dòng)物 昆明種鼠，雄性，體質(zhì)量13～14 g，潔凈級(jí)，引自山東大學(xué)動(dòng)物中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取物的制備 木芙蓉葉煎煮3 h，水提液減壓濃縮至稠浸膏，加入乙醇進(jìn)行醇沉,過濾得到沉淀，沉淀用蒸餾水溶解。用D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行洗脫得到25%乙醇洗脫液,濃縮洗脫液，使其生藥含量為0.5 g/mL，藥液過0.2 μm孔徑濾膜除菌，備用。

2.2 體外抗病毒試驗(yàn)

2.2.1 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定 將HEK-293細(xì)胞懸液接種于96孔板中,使其長(zhǎng)成單層細(xì)胞。用細(xì)胞維持液以2倍比稀釋陽(yáng)性對(duì)照藥品利巴韋林和木芙蓉葉提取物，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度縱向設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，平行方向設(shè)2行正常細(xì)胞對(duì)照。將96孔板置37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)的變化，連續(xù)觀察5 d，染色，使用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定各孔光吸收值，利用Reed-Mucnch法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)[2]。

2.2.2 藥物的抑毒作用 將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，使其長(zhǎng)成單層細(xì)胞,倒掉培養(yǎng)液，將待測(cè)藥液按2倍比稀釋順序橫向接種在各孔中,每孔100 μL藥液，然后接種100TCID50的不同病毒液50 μL，每種病毒橫向接種1行,縱向設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每塊96孔板均設(shè)置利巴韋林陽(yáng)性藥品對(duì)照，病毒對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照以及空白對(duì)照(無細(xì)胞生長(zhǎng))。置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)，以細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)為指標(biāo)，以病毒對(duì)照出現(xiàn)4級(jí)CPE為終點(diǎn)，染色，使用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定各孔光吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率，利用Reed-Mucnch法計(jì)算半數(shù)有效濃度(EC50),得到治療指數(shù)TI=(TC50/EC50)，治療指數(shù)越大表示藥物作用越強(qiáng)。細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)劃分級(jí)別[3]：0級(jí)細(xì)胞無病變出現(xiàn)，正常生長(zhǎng)；1級(jí)細(xì)胞出現(xiàn)25%以下的病變；2級(jí)細(xì)胞出現(xiàn)25%～50%的病變；3級(jí)細(xì)胞出現(xiàn)50%～75%的病變；4級(jí)細(xì)胞出現(xiàn)75%以上的病變。

2.3 體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)

2.3.1 接種病毒劑量的測(cè)定 昆明種小鼠40只，將動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為：病毒大劑量組、病毒中劑量組、病毒小劑量組和正常對(duì)照組。各組動(dòng)物乙醚麻醉[4]下分別鼻腔接種上述RSV毒液(效價(jià)320∶1)50、25、12.5 μL和細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL，常規(guī)喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物存活情況，記錄死亡動(dòng)物及時(shí)解剖，做病理學(xué)檢測(cè)。在第7天末次給藥40 min后，將動(dòng)物眼動(dòng)脈叢放血，牽頸臼處死，無菌取肺組織，做病理學(xué)檢測(cè)[5]。

2.3.2 藥物體內(nèi)抗病毒活性測(cè)定 將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病毒模型對(duì)照組、利巴韋林對(duì)照組和木芙蓉葉提取物大、中、小劑量治療組，每組10只。在乙醚麻醉下，正常組動(dòng)物鼻腔接種細(xì)胞培養(yǎng)液25 μL，其余動(dòng)物均鼻腔接種RSV毒液25 μL。藥物灌胃，每日2次，連續(xù)7 d。每日觀察動(dòng)物鼻腔是否有分泌物、存活情況，在第7天末次給藥4 h后,將動(dòng)物稱重后眼動(dòng)脈叢取血、牽頸臼處死，無菌條件下取肺組織，稱重計(jì)算肺指數(shù)，得到肺指數(shù)抑制率[5]。(肺指數(shù)=小鼠肺重/小鼠體質(zhì)量×100%；肺指數(shù)抑制率=(病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)-給藥組平均肺指數(shù))/病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)×100%)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果 木芙蓉葉體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明木芙蓉葉提取物對(duì)3種病毒都有不同程度的抑制作用,其提取物對(duì)抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的增殖有較為顯著的作用，治療指數(shù)達(dá)到了89.08，對(duì)甲型流感病毒(Flu A)也有較好的抑制作用，但對(duì)副流感病毒(HPIVs)致細(xì)胞病變的抑制作用相對(duì)較小(見表1)。

表1 木芙蓉葉體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果

3.2 體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 接種病毒劑量測(cè)定的結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，接種病毒組動(dòng)物毛色暗淡,缺乏光澤。正常對(duì)照組動(dòng)物無死亡；大劑量病毒組動(dòng)物在造模第6天死亡3只；中、小病毒劑量組動(dòng)物無死亡。大劑量組肺組織外觀出現(xiàn)明顯充血、出血斑點(diǎn)或花紋等癥狀,有2只動(dòng)物出現(xiàn)一葉肺萎縮，有3只動(dòng)物出現(xiàn)一葉肺實(shí)變；中劑量病毒組動(dòng)物肺組織也可見到充血或花紋;小劑量病毒組3只動(dòng)物肺組織出現(xiàn)斑點(diǎn)。病毒重分離大劑量病毒組有9只、中劑量8只、小劑量2只分離到病毒(見表2)?？紤]到本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察木芙蓉葉提取物防治上呼吸道感染的效果,所以決定采用25 μL病毒為造模適宜劑量。

表2 接種病毒劑量測(cè)定結(jié)果

3.2.2 藥物體內(nèi)抗病毒活性測(cè)定結(jié)果 通過統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理,病毒對(duì)照組與正常組比較肺指數(shù)有顯著差異(P<0.01)，RSV可以引起正常鼠肺指數(shù)的升高，表示造模成功；經(jīng)過藥物灌胃治療后，3組木芙蓉葉提取物給藥組，利巴韋林陽(yáng)性對(duì)照組均能降低由RSV引起的小鼠肺部感染的肺指數(shù)，與病毒對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)(見表3)。試驗(yàn)結(jié)果說明木芙蓉葉提取物可以抑制由RSV引起的小鼠上呼吸道感染,并且在一定的劑量范圍內(nèi)，其活性隨劑量的增大而增強(qiáng)。

4 討論

上呼吸道感染是臨床上的常見病，常由呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒等引起。目前治療呼吸道病毒感染的藥物主要有利巴韋林、金剛烷胺、聚肌胞等藥物[6],這些藥物的抗病毒譜相對(duì)較窄，而且這些藥物的不良反應(yīng)較大，所以尋求效果顯著、不良反應(yīng)小的藥物是目前研發(fā)的主要目標(biāo)，所以中藥成為治療病毒性上呼吸道感染的熱門。[7-8]

表3 木芙蓉葉提取物對(duì)RSV感染小鼠肺部炎癥(肺指數(shù))的影響(±s,n=10)

通過體外抗病毒實(shí)驗(yàn)證明，木芙蓉葉提取物對(duì)RSV等3種病毒均具有體外抗病毒作用，尤其是對(duì)RSV的抑制作用較強(qiáng);通過體內(nèi)試驗(yàn)從肺組織外觀可以觀察到肺組織的病變程度有了明顯的減輕，肺指數(shù)降低較為顯著,證明木芙蓉葉提取物在所試劑量范圍內(nèi)對(duì)RSV引起的肺部炎癥有明顯的抑制作用。所以綜合體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知木芙蓉葉提取物具有較好的抗病毒作用，為治療上呼吸道病毒感染疾病提供了充分的藥理藥效學(xué)基礎(chǔ)。

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