劉翠霞，林恭華，蘇建平，陳生云，張同作

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所,青海 西寧 81008； 2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049；3.中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅 蘭州 730000)

鞘翅目是昆蟲綱中最大的類群，在全球范圍內(nèi)都有分布，目前已知有36萬多種，是昆蟲綱及動物界種類最多、分布最廣的第一大目[1]。傳統(tǒng)的鞘翅目分類主要依據(jù)成蟲的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)差異進行分類。然而，相近種類鞘翅目昆蟲的幼蟲(包括卵、蛹)形態(tài)特征非常相似，有些特征在不同的發(fā)育時期不穩(wěn)定，根據(jù)非成蟲態(tài)的蟲體形態(tài)學(xué)特征進行種類鑒定非常困難，對于樣本碎片和殘缺個體更是無計可施。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起和高速發(fā)展，特別是PCR技術(shù)的日趨完善，DNA條形碼(DNA Barcoding)技術(shù)作為新的物種分類方法和手段極大地彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類的缺陷，并以其高速、快捷、準(zhǔn)確的特點成為廣大生物分類學(xué)家關(guān)注的熱點[2-8]。

DNA條形碼是一種利用短鏈DNA片段，對物種進行快速、準(zhǔn)確地識別和鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)。細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(Cytochrome Oxidase Ⅰ,COⅠ)，由于相對容易擴增，較少發(fā)現(xiàn)插入、缺失現(xiàn)象，變異速率在種內(nèi)相對較小，在種間有相對較大變異速率等優(yōu)勢[2]，已成為當(dāng)前DNA條形碼在動物界的主要分子標(biāo)記。許多基于COⅠ作為DNA條形碼分子標(biāo)記的研究都顯示了其在物種鑒定方面的巨大作用[9-12]。

DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分子鑒定中應(yīng)用較多，并以鱗翅目研究最為廣泛。Hebert等[2]應(yīng)用COⅠ基因成功鑒定出200多個鱗翅目物種。Hajibabaei等[13]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對多種熱帶鱗翅目昆蟲進行了準(zhǔn)確識別。Monaghan等[14]應(yīng)用DNA序列在馬達加斯加熱帶水生甲蟲中發(fā)現(xiàn)幾個隱存種。但是，目前國內(nèi)尚未見用DNA條形碼技術(shù)鑒定鞘翅目昆蟲的研究。因此，本研究以線粒體COⅠ基因為標(biāo)記，利用DNA條形碼技術(shù)首次對疏勒河上游及青海湖北岸常見鞘翅目幼蟲進行種類鑒定，以探討DNA條形碼技術(shù)及COⅠ基因在鞘翅目昆蟲分類鑒定中的可行性及準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1試驗材料 試驗樣品于2010 年7-8月采自疏勒河上游及青海湖北岸地區(qū)，置于無水乙醇中保存。根據(jù)形態(tài)特征選取20只鞘翅目幼蟲作為DNA樣本提取材料。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取 取整只幼蟲為材料提取基因組DNA，用蒸餾水浸泡直至幼蟲中的酒精去凈。加入700 μL細(xì)胞裂解液、4 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)及2 μL RNase A(10 mg·mL-1)進行消化，55 ℃恒溫作用直至消化完全。苯酚、氯仿/異戊醇 (24∶1)抽提，800 μL無水乙醇沉淀，產(chǎn)物以300 dd H2O溶解，用10 ms·mL-1瓊脂糖凝膠電泳檢測并估計濃度，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增與測序 以20只鞘翅目幼蟲的總DNA為模板，用引物擴增COⅠ基因的部分序列(約830 bp)。引物由上海生物工程公司(Sangon) 合成，序列是,引物1：5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′；引物2：5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′。

PCR 擴增在ABIVeritiTM 1000型PCR儀上進行，反應(yīng)體積為25 μL，其中dd H2O 18.7 μL、10×PCR Reaction Buffer 2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol·L-1) 1.2 μL(Takala)、Jerry 1.0 μL(10 μmol·L-1)、 Pat 1.0 μL(10 μmol·L-1)、Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1，Takala)、DNA模板 0.4 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物上樣至1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。檢測以Markers (Takala DL2000)作為分子量標(biāo)記。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進行測序。

1.2.3序列分析 應(yīng)用Chromas軟件對測序原始結(jié)果進行人工校對，去掉兩端不整齊的序列，利用MEGA 4.0軟件進行序列比對，同源排序，并在GenBank中應(yīng)用Blast搜索下載相似科COⅠ序列。利用MEGA 4.0對得到的20條幼蟲序列和相似性搜索下載的鞘翅目COⅠ序列用Kimura雙參數(shù)遺傳距離法計算遺傳距離，基于遺傳距離用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)樹，用Bootstrap檢驗系統(tǒng)樹各分支置信度，1 000次循環(huán)，檢查序列鑒定的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1Blast相似性搜索結(jié)果 在GenBank中用Blast搜索相似的基因序列，對比片段信息的可靠性，初步判定這20個樣本的科，亞科和屬。其中，15號鑒定至科，8、12和16號鑒定至屬，其余的鑒定至亞科。1、2、10、13和18號屬于金龜子科(Scarabaeidae)，其中，1、2號分別屬于花金龜亞科(Cetoniinae)的不同屬，10、13和18號屬于鰓金龜亞科(Melolonthinae)；8號屬于擬步甲科(Tenbrionidae)的Nyctoporis屬；12、16號屬于擬步甲科的Dailognatha屬；15號屬于天?？?Cerambycidae)；3、4、6、14和20號屬于步甲科(Carabidae)；5、7、11、19號屬于象甲科(Curculionidae)的Molytinae亞科，9、17號屬于象甲科的Curculioninae亞科。

2.2遺傳距離分析 Raupach等[15]對歐洲344個步甲科物種基于COⅠ基因序列用K2P法計算了種內(nèi)和種間遺傳距離，結(jié)果顯示，同科的平均種間距離為0.126，并且最大距離不大于0.2，而同屬的種間距離為0～0.005。鄭福山等[16]基于COⅠ基因用K2P法對葉甲科小螢葉甲屬10種昆蟲進行遺傳距離計算，結(jié)果顯示，葉甲科的種間遺傳距離介于0.169～0.198，而同屬的種間遺傳距離介于0.001～0.134，種間距離與Raupach得出的范圍較為一致。

由本研究測得的20條鞘翅目幼蟲COⅠ序列與相似性搜索下載的7條鞘翅目COⅠ序列用雙參數(shù)法計算所得遺傳距離可知(表1)，1、2、10、13和18 號與金龜子科的遺傳距離介于0.160～0.164，與其他科種間的遺傳距離均大于0.2，參考Raupach等[15]和鄭福山等[16]的同科平均種間距離小于0.2的標(biāo)準(zhǔn)，可判定這幾個鞘翅目幼蟲屬于金龜子科。以此類推，12和16號屬于擬步甲科的Dailognatha屬，8號屬于擬步甲科的Nyctoporis屬，15號屬于天?？疲?、7、9、11、17和19號屬于象甲科，3、4、6、14和20號屬于步甲科。7、9、11、17號與象甲科的兩個亞科的遺傳距離都介于0.138～0.197，說明象甲科的這兩個亞科親緣關(guān)系較近，由遺傳距離可推斷9、17號屬于象甲亞科(Curculioninae)，而5、7、11、19號屬于象甲科的Molytinae亞科。

2.3基于COⅠ條碼序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹 20個鞘翅目幼蟲COⅠ基因序列和7條從GenBank下載的鞘翅目5個科的COⅠ (566 bp)(其中象甲科和擬步甲科各有兩個亞科)基因部分序列數(shù)據(jù)通過NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。此NJ樹具有很高的置信度(圖1)，20個鞘翅目幼蟲分為5支，其中1、2、10、13、18號與金龜子科聚為一支；8、12、16號與擬步甲科聚為一支，就科內(nèi)種間關(guān)系來看，8號優(yōu)先與擬步甲科的Nyctoporis相聚，而12、16號優(yōu)先與擬步甲科的Dailognatha相聚；3、4、6、14、20號與步甲科聚為一支 ；15號與天?？凭蹫橐恢В?、7、9、11、17、19號與象甲科聚為一支，就科內(nèi)種間關(guān)系來看，9和17號與象甲科的Curculioninae亞科優(yōu)先相聚，5、7、11、19號與象甲科的Molytinae亞科優(yōu)先相聚。

圖1 NJ法構(gòu)建的鞘翅目幼蟲分子系統(tǒng)樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree of Coleoptera constructed by NJ method

3 討論

DNA條形碼開啟了物種分類鑒定的新時代，其顯著特點是可以及時快速獲得分子數(shù)據(jù)，極大地簡化物種分類和鑒定工作。mtDNA上COⅠ序列條形碼被廣泛應(yīng)用于物種分類研究。利用DNA條形碼進行分類和鑒定，能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分的新種和隱存種。在昆蟲分類鑒定方面，運用DNA條形碼技術(shù)進行種類鑒定和新種發(fā)現(xiàn)研究工作在鱗翅目[17]、等翅目[18]、鞘翅目[19]及雙翅目[20]中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，特別是鱗翅目研究中應(yīng)用最為普遍。 Hebert等[21]選取COⅠ基因的一段序列對鱗翅目200多個種進行了種類鑒定，結(jié)果表明，該特定片段可以100%成功地鑒定每個個體。迄今為止，尚未見COⅠ序列條形碼用于鞘翅目幼蟲的分類研究報道。本研究通過對鞘翅目幼蟲mtDNACOⅠ中566 bp的基因序列進行分析，利用GenBank基因序列信息，運用Blast相似性搜索，用雙參數(shù)法計算遺傳距離，并以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)樹，鑒定出20個未知鞘翅目幼蟲分別屬于5科9屬。3個分析方法所得結(jié)果基本一致，表明應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)η食崮坑紫x進行分類鑒定，mtDNACOⅠ基因用于鞘翅目幼蟲分類鑒定具有可行性、方便性和快捷性。NJ無根系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果進一步表明試驗鞘翅目幼蟲中科之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，容易區(qū)分。在科內(nèi)屬的水平，象甲科的Curculioninae屬和Molytinae屬，擬步甲科的Dailognatha屬和Nyctoporis屬也能夠明確區(qū)分。

經(jīng)過多年的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)得到了很多的支持，用DNA條形碼對物種進行鑒定研究越來越普遍，而作為能夠用作條形編碼的基因，一是必須具有相對的保守性，便于用通用引物擴增；二是必須具備足夠的變異能將物種鑒別。本研究中采用COⅠ基因不僅能擴增出鞘翅目的幼蟲，甚至能將最初錯誤判定為鞘翅目的雙翅目和膜翅目幼蟲的序列擴增出來，說明此基因在昆蟲中具有一定的保守性，而通過遺傳距離等分析，也表明mtDNA上COⅠ部分序列具有足夠的變異，能有效地對鞘翅目幼蟲進行科屬鑒定。

由于該方法快速、簡便和精確，有助于對形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的幼蟲、卵和蛹進行準(zhǔn)確地鑒定，解決了鞘翅目幼蟲、卵和蛹鑒定的一大難題。但是，對COⅠ中部分基因序列進行分析，雖然可以較精確地鑒定這20個鞘翅目幼蟲的科、屬，但對個別屬間親緣關(guān)系較近的個體(如金龜子科的各屬之間)則很難鑒別，必須依靠多個基因片段來共同鑒定，這正是未來DNA條形碼技術(shù)的重要發(fā)展方向。此外，DNA條形碼技術(shù)用基因差異計算出的遺傳距離，目前都缺少精細(xì)的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，采用通用的遺傳距離范圍不太可能解決所有的物種鑒定問題，應(yīng)該在不同的目、科甚至屬之間選用不同的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離范圍，這樣才能夠更加精確地對不同物種進行分類鑒定。

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