張玨　鄧媛媛　曾富佳

【摘要】 目的：觀察鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)w外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的增殖活性。方法：體外分離培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色鑒定成骨細(xì)胞生物學(xué)特征；將鹽酸四環(huán)素緩釋微球與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果：鹽酸四環(huán)素緩釋微球能夠在實(shí)驗(yàn)的9天內(nèi)持續(xù)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。結(jié)論：鹽酸四環(huán)素緩釋微球能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

【關(guān)鍵詞】 鹽酸四環(huán)素緩釋微球；成骨細(xì)胞；增殖

【中圖分類號(hào)】R962 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1007—8517（2013）18—0019—02

四環(huán)素及其無(wú)抗生素作用的化學(xué)異構(gòu)衍生物（CMTs）具有特殊的藥理活性：抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、抑制骨吸收、恢復(fù)成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能等，這些性質(zhì)在骨科具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。前期研究證實(shí)低濃度鹽酸四環(huán)素，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人胚成骨細(xì)胞活性及增殖，增加和加強(qiáng)細(xì)胞合成Ⅰ型膠原、骨鈣素等促進(jìn)骨生成的物質(zhì)，提示鹽酸四環(huán)素有較強(qiáng)促成骨潛能。而利用緩釋系統(tǒng)控制鹽酸四環(huán)素在組織中持續(xù)穩(wěn)定的緩慢釋放，更能滿足骨愈合再生生理學(xué)規(guī)律的要求。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)制備的鹽酸四環(huán)素緩釋微球用于成骨細(xì)胞增殖作用的研究，確定鹽酸四環(huán)素緩釋微球潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器3～7d齡健康SD大鼠10只，雌雄不限，體重20～30g（四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；鹽酸四環(huán)素緩釋微球；胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco）；Ⅰ型膠原酶（美國(guó)Sigma）；胰蛋白酶（美國(guó)Gibco）；二甲亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma）；MTT（美國(guó)Sigma）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）；CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Thermo公司）；細(xì)胞超凈工作臺(tái)（德國(guó)Thermo）；連續(xù)光譜測(cè)讀儀（美國(guó)Bio-Rad）。

1.2 方法和結(jié)果

1.2.1 SD大鼠成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定在無(wú)菌條件下剪取10只3-7d齡SD大鼠顱頂骨，用無(wú)菌PBS沖洗，并除去骨膜骨縫間結(jié)締組織和血細(xì)胞，將顱頂骨剪成約1mm×1mm碎塊，加入0.25%胰蛋白酶10ml，37℃條件下消化振蕩10min，棄上清，加入1：1（V/V）0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶的混合酶10ml，37%消化振蕩20min，并重復(fù)消化1次，收集2次消化的消化液，以400G.min-1離心5min。棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后按1×10⁴·cm^-2個(gè)細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3d后首次換液，以后間隔2天換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%～90%融合后，消化并按1：2比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)（圖1），可見(jiàn)成骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、三角形或多角形。取第2代細(xì)胞按1×10⁴·cm^-2密度分別接種于有血蓋片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)21d，取出血蓋片，PBS清洗，行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色鑒定（圖2），其結(jié)果顯示成骨細(xì)胞培養(yǎng)21d后有明顯的紅色鈣結(jié)節(jié)生成。收集第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為二組，A組：空白對(duì)照組（含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液）；B組：鹽酸四環(huán)素緩釋微球組（含10%FBS和四環(huán)素緩釋微球的DMEM培養(yǎng)液）。

1.2.3 鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)Τ晒羌?xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響取生長(zhǎng)良好的第3代成骨細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，鏡下計(jì)數(shù)后，以3×103個(gè)細(xì)胞/孔接種子24孔板上。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。置于37℃、5%C0₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，分別加入實(shí)驗(yàn)分組要求的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)1d、2d、3d、5d、7d、9d后，每日每組

2 討論

四環(huán)素的抗菌特性性質(zhì)用于局部組織中有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖的作用，并有誘導(dǎo)異位成骨的能力。在用復(fù)合鹽酸四環(huán)素的生物衍生骨修復(fù)兔橈骨缺損的研究中發(fā)現(xiàn)，其血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平，修復(fù)區(qū)成骨細(xì)胞和膠原纖維的生成均高于沒(méi)有復(fù)合四環(huán)素的對(duì)照組，而且骨愈合也早于對(duì)照組，說(shuō)明四環(huán)素在骨組織再生過(guò)程中可能起到重要作用。四環(huán)素對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究顯示：低濃度四環(huán)素可增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖明顯加快，細(xì)胞的群體倍增時(shí)間縮短。四環(huán)素促進(jìn)骨愈合的機(jī)制，可能源于初始階段的抗菌作用；也可能通過(guò)抑制膠原酶的活性使骨的形態(tài)正常，或通過(guò)降低破骨細(xì)胞的活性抑制骨吸收，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性刺激膠原的產(chǎn)生，從而促進(jìn)骨再生。為了避免四環(huán)素的突釋現(xiàn)象，滿足骨愈合再生生理學(xué)規(guī)律的要求，持續(xù)促進(jìn)骨生長(zhǎng)的作用，將鹽酸四環(huán)素制備成緩釋微球可以滿足促進(jìn)骨生長(zhǎng)的要求。經(jīng)研究，鹽酸四環(huán)素緩釋微球能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞持續(xù)增殖比鹽酸四環(huán)素多5～6天，同時(shí)，鹽酸四環(huán)素緩釋微球能顯著增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性和Ⅰ型膠原的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)單從細(xì)胞增殖的角度研究鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)Τ晒羌?xì)胞的增殖活性，從結(jié)果可以看到，鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)w外培養(yǎng)成骨細(xì)胞具有增殖作用，在骨創(chuàng)傷治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。