于子涵

摘要：傳統(tǒng)PCR技術(shù)雖然因?yàn)槠潇`敏性、特異性和快速性，自發(fā)明以來(lái)取得了廣泛應(yīng)用，但仍存在容易交叉污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性及定量不準(zhǔn)確的缺陷。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RQ-PCR）技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，由于其操作方便、反應(yīng)速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。

關(guān)鍵詞：RQ-PCR；熒光探針；分子生物；熒光共振能量轉(zhuǎn)移

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-2374（2013）13-0044-02

1 RQ-PCR技術(shù)概述

RQ-PCR是FPET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）技術(shù)在PCR定量上的應(yīng)用。其指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序及強(qiáng)弱變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。RQ-PCR同步進(jìn)行定量和擴(kuò)增，這樣就克服了傳統(tǒng)PCR的平臺(tái)效應(yīng)，減少了終點(diǎn)檢測(cè)帶來(lái)交叉污染的機(jī)會(huì)，也克服了終點(diǎn)法定量的不準(zhǔn)確性。另外，RQ-PCR無(wú)需再處理，節(jié)約了時(shí)間和精力，更避免了放射性同位素可能給實(shí)驗(yàn)人員造成的傷害。目前，RQ-PCR在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用越來(lái)越多。

1.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

當(dāng)一個(gè)熒光基團(tuán)的熒光光譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜重疊，并且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，供體熒光基團(tuán)的激發(fā)能誘發(fā)受體基團(tuán)發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光基團(tuán)自身的熒光強(qiáng)度衰減，即能量從短波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)，相當(dāng)于短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽，這個(gè)過程稱為FRET。

1.2 參照物

參照物有外參照和內(nèi)參照兩種。外參照不與目的基因在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增。以已知濃度的目的基因?yàn)槟０灏匆欢ū壤♂?，制備?biāo)準(zhǔn)曲線。而未知標(biāo)本則根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相對(duì)的拷貝數(shù)和Ct值。其優(yōu)點(diǎn)是可以和目的基因保持較高的同源性，保證了二者的擴(kuò)增效率近似。缺點(diǎn)是不能克服也無(wú)法檢測(cè)可能出現(xiàn)在樣本反應(yīng)體系中的影響因素。內(nèi)參照是在各標(biāo)本中加入已知濃度的內(nèi)參照基因，與樣本一起抽提、擴(kuò)增。內(nèi)參照基因的DNA片段與目的基因相似。為保證目的基因只能與內(nèi)參照探針結(jié)合，運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法改變與探針結(jié)合的中間部位的序列。內(nèi)參照系統(tǒng)的結(jié)果重復(fù)性更好，可以避免不同抽提效率導(dǎo)致的樣本間差異。

1.3 RQ-PCR幾個(gè)重要參數(shù)

（1）熒光域值3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍設(shè)置為熒光域值的缺省，熒光本底信號(hào)為PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)；（2）Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；（3）Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

2 RQ-PCR技術(shù)的關(guān)鍵

RQ-PCR技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了熒光染料或探針。特異的將雙鏈DNA摻入熒光染料中，保證其信號(hào)與PCR產(chǎn)物完全同步遞增。在探針的3端和5端分別標(biāo)記淬滅基團(tuán)（Q）和報(bào)告基團(tuán)（R），進(jìn)行能量的傳遞。R基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被Q基團(tuán)吸收或抑制；抑制作用隨著兩者距離變遠(yuǎn)而消失，R基團(tuán)增強(qiáng)后的熒光信號(hào)可以被熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到。當(dāng)熒光信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值時(shí)，Ct值被記錄下來(lái)。這樣，通過未知樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以將該樣品的起始拷貝數(shù)確定。因此，在RQ-PCR中，熒光染料或探針就成為了技術(shù)關(guān)鍵。目前已經(jīng)開發(fā)出的熒光染料和探針按照能量轉(zhuǎn)移和基團(tuán)標(biāo)記的方式，大體可以分為水解類探針和雜交類探針兩類。

2.1 Taq Man探針法

在該探針的3末端和5末端分別標(biāo)記Q基團(tuán)和R基團(tuán)，使其與兩引物所包含的一段序列內(nèi)DNA模板完全互補(bǔ)。當(dāng)探針完整時(shí)，利用Taq酶5→3外切酶的活性，Q基團(tuán)吸收R基團(tuán)的熒光，熒光信號(hào)也就不能被檢測(cè)到；相反如果正確的底物被擴(kuò)增出來(lái)后，即有特異的PCR發(fā)生時(shí)，探針就會(huì)在復(fù)性階段與其雜交，當(dāng)聚合酶延伸到探針時(shí)，它就會(huì)將與模板雜交上的探針切碎，使得R基團(tuán)和Q基團(tuán)分開，解除淬滅作用，從而釋放出熒光信號(hào)，可通過檢測(cè)系統(tǒng)觀察到信號(hào)的變化。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就會(huì)有一個(gè)游離的熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，進(jìn)而計(jì)算出Rn值、△Rn值、Ct值和閾值。通過計(jì)算就可以獲得起初模板量。常用的熒光基團(tuán)是VIC、TET、FAM、HEX。

2.2 非特異性雙鏈DNA嵌入染料

SYBR Green 1是一種與雙鏈DNA結(jié)合的染料。當(dāng)它游離在溶液中時(shí)，不發(fā)出熒光；但當(dāng)其摻入DNA雙鏈后，會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈熒光。該染料最大的優(yōu)點(diǎn)是可以作用于任何模板的任何引物。但由于其對(duì)DNA模板沒有選擇性，可能會(huì)造成定量不準(zhǔn)確。若想解決這個(gè)問題，可以使用比較由于融解曲線法，還可以通過反應(yīng)條件的優(yōu)化及嚴(yán)格設(shè)計(jì)高特異性引物，降低引物二聚體形成的可能性。

2.3 分子信標(biāo)

分子信標(biāo)由Tyagi和Krammertm建立，適用于鑒定點(diǎn)突變。該探針是單鏈DNA所形成的呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸，環(huán)部部分堿基同靶DNA序列互補(bǔ)，長(zhǎng)度為15～35個(gè)核苷酸；莖部有互補(bǔ)配對(duì)的堿基組成，同靶DNA無(wú)序列同源性，約5～7個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在探針的5端標(biāo)記R基團(tuán)，3端標(biāo)記Q基團(tuán)。當(dāng)分子信標(biāo)游離時(shí)，由于R、Q兩個(gè)基團(tuán)緊密相鄰，熒光被淬滅。而在PCR變性后的復(fù)性階段，分子信標(biāo)與溶液中的特異模板雜交，靶DNA序列與分子信標(biāo)環(huán)部的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合，使發(fā)卡結(jié)構(gòu)破壞，釋放出熒光信號(hào)，淬滅作用被解除。由于熒光強(qiáng)度會(huì)隨著分子信標(biāo)量的增加而增加，從而達(dá)到定量檢測(cè)的目的。在PCR的延伸階段，分子信標(biāo)與模板解離，再次形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光消失。每次擴(kuò)增后產(chǎn)物的積累量可以通過當(dāng)時(shí)的熒光強(qiáng)度的增加來(lái)反映。該方法的優(yōu)點(diǎn)是探針可循環(huán)利用，缺點(diǎn)是標(biāo)記相對(duì)復(fù)雜。同時(shí)，莖部結(jié)構(gòu)的高熱力學(xué)溫度會(huì)影響探針和靶序列的雜交。

2.4 雜交探針

雙雜交探針也是以FRET為原理進(jìn)行的。該方法使用四個(gè)寡聚核苷酸分子、兩個(gè)引物和兩個(gè)探針。發(fā)光探針的5端標(biāo)記一個(gè)R基團(tuán)，淬滅探針的3端標(biāo)記Q基團(tuán)，雜交時(shí)R基團(tuán)緊密相鄰Q基團(tuán)，以首尾相接的方式退火靶擴(kuò)增子，當(dāng)循環(huán)儀的光源激發(fā)3端的Q基團(tuán)后，產(chǎn)生從供體到毗鄰探針R基團(tuán)的FRET使熒光淬滅。起始模板的量越高，熒光淬滅的程度越低，以此可以進(jìn)行PCR的定量分析。該方法的優(yōu)點(diǎn)是淬滅效率高，缺點(diǎn)是擴(kuò)增效率不穩(wěn)定，合成成本相對(duì)較高。

3 RQ-PCR技術(shù)的應(yīng)用

3.1 基因工程研究領(lǐng)域

RQ-PCR技術(shù)的出現(xiàn)加強(qiáng)了對(duì)基因的量和質(zhì)變化的研究。它目前已經(jīng)在遺傳分析中廣泛應(yīng)用以檢測(cè)基因突變及基因組的不穩(wěn)定性。

（1）基因表達(dá)研究由于探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關(guān)，可以將由不同熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的探針與野生型和突變基因雜交，2005年劉敬忠等使用RQ-PCR技術(shù)對(duì)β地中海貧血純、雜合子作出診斷。目前對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的疾病還無(wú)法根治，而應(yīng)用RQ-PCR技術(shù)可以通過產(chǎn)前監(jiān)測(cè)和產(chǎn)前基因診斷來(lái)減少病嬰出生。

（2）轉(zhuǎn)基因研究Tesson等確定了分析轉(zhuǎn)基因鼠接合性的RQ-PCR技術(shù)使用條件，利用合適的循環(huán)域值及發(fā)光探針，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因。通過RQ-PCR檢測(cè)，同型結(jié)合的和異質(zhì)接合的動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況與孟德爾遺傳規(guī)律相符。這項(xiàng)技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于基因劑量功效實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的繁育中。

（3）單核苷酸多態(tài)性與突變的分析RQ-PCR可以用來(lái)檢測(cè)基因突變和基因組的不穩(wěn)定性。一條橫跨突變位點(diǎn)的探針和一條錨定探針是檢測(cè)基因突變的基礎(chǔ)。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如果靶序列中無(wú)突變，探針雜交便完全配對(duì)；如果靶序列和探針不完全配對(duì)，會(huì)降低雜交體的穩(wěn)定性和熔解溫度。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。

3.2 醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

（1）病原體檢測(cè)2000年蘇學(xué)飛等利用該技術(shù)對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒五個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行了定量測(cè)定。2004年針對(duì)SARS流行性病的檢測(cè)和診斷使得RQ-PCR技術(shù)得以應(yīng)用和發(fā)展。近年來(lái)，TaKaRa公司推出的試劑盒可以一步完成對(duì)H5N1、H7N9等禽流感病毒的檢測(cè)。

（2）腫瘤診斷基因發(fā)生了變異是腫瘤產(chǎn)生的根本，RQ-PCR方法可以將這些異常變化都檢測(cè)出來(lái)。許多癌基因的突變和表達(dá)增加，在腫瘤早期就出現(xiàn)。除了能夠有效地檢測(cè)基因突變，RQ-PCR還能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到癌變基因的表達(dá)量。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因被不斷地發(fā)現(xiàn)，會(huì)使RQ-PCR技術(shù)在腫瘤的研究中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

（3）抗藥性考核日本Funato等使用RQ-PCR技術(shù)對(duì)臨床樣品中如MRP、MDR21等與抗藥性相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，RQ-PCR技術(shù)可以可靠地定量檢測(cè)抗藥基因的表達(dá)，運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)化療可能引起的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)在，RQ-PCR技術(shù)不僅快速、靈敏、準(zhǔn)確，而且己經(jīng)發(fā)展為一項(xiàng)高度自動(dòng)化的核酸定量技術(shù)，大大降低了假陽(yáng)性率，提高了工作效率，且不必使用對(duì)人體有害的染色劑。因此該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用在基因表達(dá)研究、基因單核苷酸多態(tài)性和遺傳性疾病診斷、病原微生物診斷等諸多科研領(lǐng)域。但與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，RQ-PCR也存在不足之處：（1）RQ-PCR在復(fù)合式檢測(cè)方面的應(yīng)用能力會(huì)因檢測(cè)光源和熒光素種類的局限所限制；（2）由于檢測(cè)環(huán)境相對(duì)封閉，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測(cè)步驟，也就無(wú)法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小進(jìn)行監(jiān)測(cè)；（3）RQ-PCR實(shí)驗(yàn)的高成本也限制了其廣泛的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：周 瓊）