盛銘浩 徐鳳花 代歡 張晴

摘要：以腐木和堆肥樣品為材料，通過(guò)限制性繼代培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，篩選出一組高效穩(wěn)定的低溫纖維素降解復(fù)合菌系Y。對(duì)復(fù)合菌系Y不同生長(zhǎng)階段pH、酶活、失重率及產(chǎn)物之間的相互關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，0～6 d為復(fù)合菌系Y的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4 d內(nèi)濾紙條完全崩解，在20 ℃下靜置培養(yǎng)10 d，水稻秸稈的降解率達(dá)到59%，酶活為103.5 U/mL，主要代謝產(chǎn)物為乙酸，并有少量的丁酸和丙酸，含量分別為1.70、0.21、0.12 g/L，其中乙酸占總揮發(fā)酸含量的85%。復(fù)合菌系Y適用于以秸稈為原料的低溫產(chǎn)沼氣發(fā)酵。

關(guān)鍵詞：低溫纖維素降解復(fù)合菌系；選育；水稻秸稈；代謝產(chǎn)物

中圖分類(lèi)號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）08-1814-03

我國(guó)每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達(dá)7億多噸，除很少一部分得到利用外，大部分被堆積或焚燒，不僅浪費(fèi)資源，還對(duì)環(huán)境造成污染[1]。利用微生物發(fā)酵技術(shù)將纖維素轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸、醇、甲烷以及氫氣等化工原料和能源[2]，對(duì)解決當(dāng)今所面臨的能源危機(jī)和環(huán)境污染問(wèn)題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

由于很多菌株不能產(chǎn)生全組分的纖維素酶，且所產(chǎn)酶的活性不高，常常依靠?jī)煞N或多種微生物共同培養(yǎng)完成，因此，復(fù)合菌系的作用逐漸得到重視[3-6]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于纖維素降解菌研究主要集中在單菌株的分離篩選、鑒定以及中高溫復(fù)合菌系的選育[7-9]，對(duì)低溫纖維素降解復(fù)合菌系的研究較少。因此，試驗(yàn)通過(guò)限制性繼代培養(yǎng)，從3種不同樣品中馴化篩選復(fù)合菌系，并就其對(duì)纖維素的降解能力以及在培養(yǎng)過(guò)程中pH、酶活及產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究與分析，以期選育出一組高效穩(wěn)定的低溫纖維素降解復(fù)合菌系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 黑龍江北部山區(qū)腐木、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室堆肥樣品及沼渣，樣品編號(hào)分別為YC、DF、ZZ。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體篩選培養(yǎng)基[8]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，粉碎水稻秸稈2 g，微量元素溶液0.5 mL，去離子水1 000 mL。

微量元素溶液成分（g/L）[9]：ZnSO4 0.29，CaCl2 0.24，CuSO4 0.25，MgSO4 0.17。

1.2 試驗(yàn)方法

將3種樣品接入200 mL篩選培養(yǎng)基中，放入兩片濾紙條作為指示，20 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。待濾紙條降解完全時(shí)，轉(zhuǎn)接于同樣的新鮮培養(yǎng)液中，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，篩選降解速度快且性能穩(wěn)定的樣品，并將其相互配合培養(yǎng)，直至篩選高效穩(wěn)定的復(fù)合菌系。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 纖維素失重率的測(cè)定 將培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液離心，去上清，然后用鹽酸和硝酸的混合液沖洗剩余物，以除去殘留的菌體和碳酸鈣，再用清水反復(fù)沖洗多次，最后置于烘箱中烘至恒重[3]。計(jì)算失重率。

1.3.2 纖維素酶活性測(cè)定 培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，DNS法[10]測(cè)定上清液Cx酶、C1酶和β-葡萄糖苷酶的活性。定義40 ℃反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)生1 mmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶活單位[11]。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的制作 用250 mL的葡萄糖瓶裝入180 mL培養(yǎng)基，接入20 mL種子液，20 ℃靜置培養(yǎng)，每隔24 h取樣，用北京普析T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度，以未接菌的培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.3.4 pH測(cè)定 采用上海偉業(yè)儀器廠(chǎng)pHS-3C型數(shù)字pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 培養(yǎng)液中有機(jī)酸含量測(cè)定 采用美國(guó)Agilent 6890N型氣相色譜對(duì)接菌10 d的培養(yǎng)液進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.3.6 水稻秸稈纖維組織電鏡觀(guān)察 將復(fù)合菌系Y以5%接種于篩選培養(yǎng)液（水稻秸稈未經(jīng)粉碎），同時(shí)以未接菌的培養(yǎng)液作為對(duì)照，培養(yǎng)7 d，在掃描電子顯微鏡（SEM）下觀(guān)察水稻秸稈組織變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系的馴化篩選結(jié)果

采用1.2的馴化篩選方法，樣品YC和DF培養(yǎng)物在20 ℃靜置培養(yǎng)條件下都有較強(qiáng)纖維素分解能力，將這兩種培養(yǎng)液混合，得到復(fù)合菌系Y，復(fù)合菌系Y在4 d內(nèi)可使濾紙條完全崩解，將Y、YC、DF 3種樣品繼續(xù)傳代馴化直到降解能力達(dá)到穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)幾代培養(yǎng)之后復(fù)合菌系Y的酶活一直保持較高水平并且十分穩(wěn)定，第10天降解率可達(dá)到59%（圖1），總酶活達(dá)到103.5 U/mL（圖2）。

2.2 復(fù)合菌系Y生長(zhǎng)曲線(xiàn)

從圖3可以看出，復(fù)合菌系Y沒(méi)有經(jīng)過(guò)延滯期就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，原因可能是微生物經(jīng)過(guò)多代馴化，復(fù)合菌系Y自身形成了相對(duì)的生態(tài)穩(wěn)定性[13]，從而使其在極短的時(shí)間內(nèi)就適應(yīng)了培養(yǎng)環(huán)境。微生物數(shù)量迅速增長(zhǎng)并在第6天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，可能是因?yàn)閺?fù)合菌系Y剛接入培養(yǎng)液時(shí)，營(yíng)養(yǎng)成分充足，生長(zhǎng)較快，但是隨著大量代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，微生物的生長(zhǎng)受到抑制，從而導(dǎo)致微生物數(shù)量下降。

2.3 復(fù)合菌系Y對(duì)水稻秸稈的降解效果

在SEM下觀(guān)察水稻秸稈表面，結(jié)果表明，未經(jīng)過(guò)處理的水稻秸稈纖維結(jié)構(gòu)完整規(guī)則，纖維表面致密（圖4A），這種致密的結(jié)構(gòu)影響了纖維素與酶的接觸，進(jìn)而影響了纖維素的降解；經(jīng)復(fù)合菌系Y降解處理后的水稻秸稈纖維結(jié)構(gòu)松散，表面組織被嚴(yán)重破壞（圖4B），說(shuō)明復(fù)合菌系Y對(duì)水稻秸稈纖維組織有較強(qiáng)的破壞作用，提高了纖維素的降解效率。

2.4 水稻秸稈降解液pH和復(fù)合菌系Y所產(chǎn)酶總酶活的變化

pH能夠迅速下降到弱酸性，再恢復(fù)到弱堿性并保持穩(wěn)定的變化規(guī)律，是復(fù)合菌系具有正常分解能力的體現(xiàn)[14]。從圖5可以看出，pH首先出現(xiàn)一個(gè)緩慢的下降階段，第4天下降到7.0，之后逐漸上升，到第6天達(dá)7.4，之后再次下降，直至第9天降到最低值6.7，之后呈現(xiàn)持續(xù)增高趨勢(shì)。從圖6可以看出，總酶活變化大致呈正態(tài)分布曲線(xiàn)，在7～10 d達(dá)到并維持較高水平，最高值為103.5 U/mL，此后總酶活開(kāi)始下降。

通過(guò)對(duì)pH和總酶活變化的對(duì)比分析，可以在一定程度上反映出復(fù)合菌系Y產(chǎn)酶變化規(guī)律：在0～4 d時(shí)pH下降至較低值7.0，總酶活開(kāi)始上升，pH在第6天達(dá)較高值7.4后總酶活呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)，pH在總酶活最高點(diǎn)附近達(dá)到最低點(diǎn)，可能是因?yàn)槔w維素降解菌株在菌群中占據(jù)了主導(dǎo)地位，伴隨菌體的大量生長(zhǎng)和產(chǎn)酶高峰的到來(lái)，纖維素快速轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)并在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了乙酸等代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致pH出現(xiàn)明顯的下降。在總酶活達(dá)到最高時(shí)，原料逐步消耗，之后pH 穩(wěn)定上升，總酶活開(kāi)始下降，原因可能是隨著纖維素的消耗，培養(yǎng)基中碳源匱乏導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)變緩進(jìn)入衰退期，導(dǎo)致產(chǎn)酶下降，隨著菌體的大量死亡裂解，使pH升高。

2.5 水稻秸稈降解液中VFA的變化

在復(fù)合菌系Y的培養(yǎng)過(guò)程中，乙酸為降解的主要產(chǎn)物，其含量遠(yuǎn)大于丙酸和丁酸。從圖7可以看出，從培養(yǎng)第1天開(kāi)始，降解液中乙酸含量就開(kāi)始持續(xù)升高，并在第10天達(dá)到峰值1.7 g/L，而揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）含量也達(dá)到2.0 g/L，10 d后VFA含量逐漸下降，這一變化趨勢(shì)與pH變化規(guī)律相吻合，也解釋了復(fù)合菌系Y中微生物數(shù)量從第10天開(kāi)始迅速下降的原因。

3 結(jié)論

通過(guò)馴化篩選，3種復(fù)合菌系YC、DF、Y在20 ℃條件下靜置培養(yǎng)10 d水稻秸稈的降解率分別為45%、20%、59%，總酶活分別為70.0、66.0、103.5 U/mL。

復(fù)合菌系Y在20 ℃下具有較高活性，0～6 d內(nèi)菌系處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其主要代謝產(chǎn)物為乙酸、丙酸和丁酸，其中乙酸占85%。

復(fù)合菌系Y在20 ℃條件下具有較高的纖維素降解能力，有助于加速低溫條件下廢棄纖維素降解的研究開(kāi)發(fā)，實(shí)現(xiàn)農(nóng)村廢棄纖維素?zé)o害化處理、資源化利用，其主要產(chǎn)物為乙酸，可為以秸稈為原料的低溫沼氣發(fā)酵提供前體物質(zhì)[14]，提高產(chǎn)沼氣的發(fā)酵降解效率。

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