李勇超 任永信 陳宏恩 楊靖 周修任

摘要：試驗以不同地理區(qū)域中藥種植上所用的菘藍栽培居群為材料，通過對與菘藍藥用有關的植物學性狀指標（株高、葉面積、葉干重、根干重）的遺傳多樣性指數(shù)統(tǒng)計、主要藥用有效成分（靛藍、靛玉紅）的含量測定、酯酶等位酶酶譜的建立與聚類分析，計算了用于衡量菘藍居群內變異水平的多態(tài)位點比率、有效等位基因數(shù)、觀察雜合度3個指標，探討了常見的栽培菘藍各居群之間的遺傳多樣性關系，以揭示菘藍在形態(tài)、主效成分及同工酶3個層次上的遺傳多樣性變化。結果表明，河北安國（S1）、安徽亳州（S2）和河南新鄉(xiāng)（S3）3個居群的植物學性狀指標的平均遺傳多樣性指數(shù)分別為0.870、0.877、0.763，各植物學性狀的遺傳多樣性指數(shù)在各居群內從高到低的排序多數(shù)為株高、葉面積、葉干重、根干重；3個居群在表型上居群間的差異不顯著（P>0.05），而居群內多樣性豐富。S1的靛藍和靛玉紅的含量分別為5.67、10.93 mg/g，S2的分別為4.74、9.68 mg/g，S3的分別為5.32、9.27 mg/g，2種成分的含量分別具極顯著差異水平（P<0.01）。90個樣品的平均有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點比率、觀察雜合度分別是1.346 9、61.53%、0.346 9；在相似系數(shù)0.70處可聚為3類，第Ⅰ聚群包含有66個樣品，第Ⅱ聚群包含有10個樣品，第Ⅲ聚群包含有14個樣品，分別占樣品總數(shù)的73%、11%和16%，顯示出了3個菘藍居群具有豐富的遺傳多樣性和種質資源的流動性。

關鍵詞：菘藍；居群；遺傳多樣性

中圖分類號：S567.23+9；Q944.5；Q346+.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1842-06

菘藍（Isatis indigotica Fort.）別名大靛，為十字花科（Cruciferae）菘藍屬（Isatis L.）草本植物，其根在中藥里名為板藍根（Radix Isatidis），又叫北板藍、大青根等，其葉為大青葉（Folium Isatidis），將鮮葉加工后稱青黛，均可入藥。板藍根性寒、味苦，有清熱解毒、涼血消腫之功效，臨床上廣泛用于抗菌、抗病毒等病癥的治療[1]，還有增強機體免疫功能[2]、抗內毒素等作用[3]。菘藍所含的主要藥用有效成分吲哚類生物堿為靛藍（Indigo）和靛玉紅（Indirubin），是板藍根最重要的活性成分[4]。目前菘藍在藥用植物栽培生產(chǎn)上有相當?shù)姆N植規(guī)模。但在實際生產(chǎn)中，由于獲種渠道狹窄和育種相對滯后等原因，導致了栽培上菘藍品種混雜退化，產(chǎn)量和質量參差不齊，也使得用此原料炮制的板藍根飲片及其他加工藥品療效不穩(wěn)，嚴重制約了菘藍的生產(chǎn)和應用，因此有必要對栽培用菘藍的種質資源遺傳多樣性進行科學比較。

菘藍在我國分布較廣，各地形成了不同的栽培品種，并且品種的遺傳變異較大；而中藥板藍根的道地性主要體現(xiàn)在種質資源方面，環(huán)境因素反而是其次的[5]。作為同工酶（Isozyme）的酯酶（Esterase，EST）等位酶（Allozyme），由于具有不易受外界環(huán)境條件影響、具有穩(wěn)定的遺傳特性、酶譜類型豐富等特點，常被用做遺傳標記，以作為基因和性狀的聯(lián)結物用以識別基因的存在與表達[6]，從而在植物的遺傳多樣性研究方面被廣泛應用，如已經(jīng)報道的有油菜（Brassica napus L.）[7]，菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）[8]，胡盧巴（Trigonella foenum-graecum L.）[9]等酯酶等位酶的研究；因此可以用酯酶等位酶對菘藍的遺傳多樣性進行分析，且相關研究尚未見報道。試驗以不同地理區(qū)域生產(chǎn)上所用的菘藍栽培居群為材料，通過對其與藥用有關的植物學性狀指標、主要藥用有效成分含量以及酯酶等位酶酶譜等方面的研究，對菘藍進行了遺傳多樣性分析，旨在了解常見的栽培菘藍各居群之間的遺傳多樣性關系，為菘藍的新品種選育及品質改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菘藍種子來自國內3個藥材產(chǎn)地，分別是河北省安國市（用S1表示，以下類推）、安徽省亳州市（S2）及河南省新鄉(xiāng)市（S3），將3個產(chǎn)地的菘藍種子播種在河南科技學院百泉校區(qū)的試驗田內，正常管理；待植株長成后，在田間選取生長正常植株的根系和地上部分的葉片，分別測量其植物學性狀指標；并以根系為材料實施有效成分測定，以葉片為材料實施等位酶的分析。

1.2 儀器和試劑

儀器主要有L-90型葉面積儀（加拿大SINTEK公司），SPECORD200型紫外-可見光分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司），RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），DYY-12型電泳儀（北京市六一儀器廠），DYCZ-28C垂直電泳槽（北京市六一儀器廠），F(xiàn)A2104S電子天平（上海天平儀器廠），DHG-9420A-電熱鼓風干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）。試劑方面，靛藍、靛玉紅標準品由中國藥品生物制品檢定所提供，Tris、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED等購自生工生物工程（上海）股份有限公司，α-醋酸萘酯、β-醋酸萘酯、固藍RR鹽等購自北京索萊寶科技有限公司，氯仿、HCl等為河南科技學院生物工程系實驗室原備，試驗用水為雙蒸水，由實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 植物學性狀指標測定方法 采用葉面積儀測量3個菘藍居群的植株相同部位當年生正常葉片，每個居群隨機取10株，每株取1片葉，葉面積測量的具體操作按說明書完成，單葉面積取均值。株高在當年用直尺在田間取3個菘藍居群各10株實施測量，取均值；干重則將菘藍葉片（當年生）與根系（二年生）于每個居群隨機取10片（株），清洗干凈后晾干，然后在電熱鼓風干燥箱里先105 ℃烘30 min、再80 ℃烘至恒重，冷卻后稱干重，取均值。

1.3.2 靛藍和靛玉紅含量測定方法 參照董娟娥等[10]和吳彥[11]的方法，略有改進。①標準品溶液的制備。分別準確稱取靛玉紅標準品2.5 mg、靛藍標準品2.5 mg，用氯仿溶解于小燒杯中，然后用氯仿定容于25 mL容量瓶中，各配制成0.1 mg/mL 的標準品溶液。②待測樣溶液的制備。分別精確稱取3個產(chǎn)地的菘藍根系樣品各2 g（干品），磨碎，置于150 mL平底燒瓶中，加入100 mL氯仿， 于80 ℃水浴中索氏提取法提取8 h，旋轉蒸發(fā)濃縮提取液，氯仿定容至25 mL，待測。③靛藍和靛玉紅最大吸收波長及計算公式的確定。以氯仿為空白樣，將標準溶液置于1 cm石英比色皿中，用紫外-可見光分光光度計在200～800 nm 段變化波長，測定吸光度，重復6次，取均值，確定最大吸收的波峰。④穩(wěn)定性試驗。以氯仿為空白對照，分別在波長609 、540 nm 處測定靛藍和靛玉紅標準品溶液的濃度，每隔2 h測定1 次，測定5 次后，過24 h再測1 次，取均值。⑤ 靛藍和靛玉紅含量的測定。以氯仿為對照，在一定波長下測定待測樣溶液的吸光度，重復6次，取均值，由公式計算出待測樣溶液中靛藍和靛玉紅的含量。⑥精密度試驗。以氯仿為空白， 分別于波長609、540 nm處測定靛藍、靛玉紅標準品溶液的濃度，重復6次，取均值。

1.3.3 酯酶等位酶的提取和電泳檢測 聚丙烯酰胺凝膠電泳參照楊靖等[12]的方法并有所改進。從菘藍S1、S2和S3群體中隨機分別采集30個樣品的葉片，共90個樣品，先用自來水沖洗干凈，再用去離子水漂洗后晾干水分，每樣稱重0.5 g，按樣品∶提取液=1∶2（W/V）的比例加提取液（1.5 mol/L、pH 8.3的Tris-HCl加2% β-巰基乙醇），即1 mL，然后在冰浴條件下研磨，勻漿；接著12 000 r/min離心10 min，取上清液放入冰箱保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠濃度為5.6%，濃縮膠濃度為3.0%。點樣孔為10泳道，每樣品按40 μL的點樣量點樣2泳道，從左到右按順序依次進行點樣。在4 ℃冰箱中進行電泳，電泳采取穩(wěn)壓方式，濃縮膠電壓150 V，分離膠電壓350 V，整個電泳過程約需4～5 h。酯酶等位酶采用α-醋酸萘酯加β-醋酸萘酯加固藍RR鹽溶液復合染色，染色時間3 min左右，待顯現(xiàn)條帶后立即取出（由于取出后凝膠上仍附著有染液，且染色速度極快，并且在轉移至漂洗的過程中還在繼續(xù)染色，故不必等條帶徹底顯現(xiàn)才取出，否則會造成條帶過寬而重疊，統(tǒng)計時損失條帶），染色完畢后，用清水漂洗3～5遍即可。對膠板進行照相，統(tǒng)計條帶并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 植物學性狀數(shù)據(jù)分析 菘藍的株高、葉面積、葉干重和根干重4個數(shù)量性狀參考丁艷來等[13]的方法進行分級，以平均數(shù)（x）為基準，0.25s為級差（s為標準差），最小級為小于x-2s，最大級為大于x +2s，用分級數(shù)據(jù)計算遺傳多樣性指數(shù)（以Simpson指數(shù)[14]H為指標，H=1-■Pi2，其中Pi為某個級別出現(xiàn)的頻率，n為級別總數(shù)），并采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對植物學性狀進行方差分析。

1.4.2 酯酶等位酶圖譜和聚類分析 統(tǒng)計電泳條帶并計算用于衡量居群內變異水平的3個指標[8]，分別為：①多態(tài)位點比率（Percentage of polymorphic loci，P），P=（多態(tài)位點數(shù)/檢測位點總數(shù)）×100%；②平均有效等位基因數(shù)（Mean effective number of alleles per locus，Ae），Ae=各位點有效等位基因總和/檢測位點總數(shù)；③觀察雜合度（Mean observed heterozygosity per locus，Ho），Ho=雜合體個體數(shù)/樣本大小。并且根據(jù)電泳條帶將每個遷移率位點上條帶的有、無分別用1和0表示，建立90個樣品的酯酶等位酶酶譜，隨機取其中10個樣品做代表性分析。再根據(jù)文獻[15]的方法計算相似系數(shù)，建立相似矩陣，采用NTSYSpc-2.10 e程序[16]，以非加權成對數(shù)據(jù)分析法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）將90個樣品經(jīng)聚類分析按照Neis遺傳距離理論生成系統(tǒng)樹。

2 結果與分析

2.1 3個菘藍居群植物學性狀的多樣性

3個菘藍居群株高、葉面積、葉干重和根干重4個植物學性狀指標的測定結果（均值）見表1，分別對這4個性狀進行單因素方差分析，其中株高方差分析的結果見表2，而葉面積、葉干重和根干重3個性狀的方差分析結果與株高類似，故略去，而以株高方差分析的結果代表之。3個菘藍居群4個植物學性狀指標的多樣性分析結果見表3。從表2、表3可見，4個性狀在3個菘藍居群間沒有顯著性差異。然而在居群內表現(xiàn)出較高的多樣性，如株高平均為74.05 cm、變幅為45.6～86.9 cm、變異系數(shù)為12.8%；葉面積平均為76.06 cm2、變幅為62.49～88.62 cm2、變異系數(shù)為9.4%；葉干重平均為0.89 g、變幅為0.65～1.09 g、變異系數(shù)為8.1%；根干重平均為5.58 g、變幅為4.53～6.87 g、變異系數(shù)為9.7%。另外，株高與葉面積、葉干重、根干重都沒有明顯的相關性，而葉面積和葉干重有顯著的正相關性（r=0.90）。由表1、表2和表3可見，栽培用的菘藍種質資源不具備明顯的品種特征，根據(jù)田間植株的外部特征難以區(qū)分居群之間的差異。

從表3還可見，綜合3個菘藍居群的株高、葉面積、葉干重和根干重4個植物學性狀指標，其Simpson指數(shù)平均為0.912，河北安國、安徽亳州和河南新鄉(xiāng)3個居群的平均Simpson指數(shù)分別為0.870、0.877和0.763?？傮w上表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，其中在各居群內部表現(xiàn)出相同的規(guī)律性，Simpson指數(shù)從高到低的排序多數(shù)為株高、葉面積、葉干重、根干重。

2.2 靛藍和靛玉紅的含量

靛藍和靛玉紅的吸收光譜測定結果見圖1，根據(jù)圖1，靛藍和靛玉紅的最大吸收波長分別為609 nm和540 nm。以氯仿做空白樣， 分別在609 nm和540 nm處測定靛藍、靛玉紅標準溶液的吸光度。根據(jù)Lambert-Beer定律：A=E·C（A表示吸光度，E表示消光系數(shù)，C表示溶液的濃度），分別計算出4個消光系數(shù)。當波長為609 nm 時，E609靛藍=27.03，E609靛玉紅=4.82；當波長為540 nm時，E540靛藍=12.34，E540靛玉紅=15.47。

靛藍、靛玉紅含量的計算公式分別為：

C靛藍=4.31×10-2×A609-1.34×10-2×A540；

C靛玉紅=7.53×10-2×A540-3.43×10-2×A609。

式中： C靛藍為靛藍在待測溶液中的質量濃度（mg/mL），C靛玉紅為靛玉紅在待測溶液中的質量濃度（mg/mL），A609為待測溶液在波長609 nm處的吸光度值，A540為待測溶液在波長540 nm處的吸光度值。經(jīng)測定，靛藍和靛玉紅在4 ℃下可放置24 h，精密度（相對標準偏差，RSD）分別為2.86%和2.94%。3個菘藍居群的靛藍和靛玉紅的含量測定結果見表4，單因素方差分析結果[F靛藍=13.86，F(xiàn)靛玉紅=15.08；F0.01（2，6）= 10.92]顯示，3個菘藍居群中的靛藍和靛玉紅含量都達到極顯著差異水平。

2.3 等位酶酶譜分析

參照王中仁[17]的方法，對90個不同種質來源的菘藍樣品進行酯酶等位酶酶譜分析，隨機取其中10個菘藍樣品做代表性分析，結果見圖2。通過酯酶等位酶酶譜分析，確定了5個酯酶等位酶基因位點，即EST-1、EST-2、EST-3、EST-4、EST-5，其中EST-1為慢速帶，EST-2和EST-3為中速帶，EST-4和EST-5為快速帶；在90個隨機樣品中共獲得了13條EST帶，分別為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M，其中EST-2 的D帶、EST-3的H和I帶、EST-4 的K帶以及EST-5的M帶為90個隨機樣品的共有譜帶；其有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點比率、觀察雜合度分別是1.346 9、61.53 %、0.346 9；其中遺傳多樣性最豐富的是S1居群，其平均有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點比率、觀察雜合度分別是1.432 6、69.23%、0.432 6，說明S1居群的種質來源要比S2和S3居群更為廣泛，是試驗取材與品種選育的良好資源。

2.4 聚類分析

采用NTSYSpc-2.10 e程序、以非加權成對數(shù)據(jù)分析法將不同種質來源的3個菘藍居群的共90個被測樣品的酯酶等位酶酶譜條帶數(shù)經(jīng)聚類分析生成系統(tǒng)樹，結果見圖3。從圖3可見，90個樣品在相似系數(shù)0.70處可聚為3類，可明顯地分為3組；第Ⅰ聚群包含有66個樣品，占總樣品數(shù)的73%；第Ⅱ聚群包含有10個樣品，占總樣品數(shù)的11%；第Ⅲ聚群包含有14個樣品，占總樣品數(shù)的16%。其中第Ⅰ聚群的66個樣品來自于S1、S2、S3居群的數(shù)目分別是17、24、25，第Ⅱ聚群的10個樣品來自于S1、S2、S3居群的數(shù)目分別是3、3、4；第Ⅲ聚群的14個樣品來自于S1、S2、S3居群的數(shù)目分別是10、3、1。由此可見，3個居群并沒有體現(xiàn)出明顯的地理位置特征，但是反映出居群S1較S2、S3具有更豐富的遺傳多樣性這一特征，聚類結果與酯酶等位酶酶譜的居群內產(chǎn)生變異的有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點比率、觀察雜合度3個指標所顯示的結果一致，也和植物學性狀的Simpson多樣性指數(shù)結果較為接近；居群S2和S3的遺傳多樣性雖然不及居群S1，但展示出了這2個居群作為栽培種的整齊性和相似性優(yōu)勢，這也跟酯酶等位酶酶譜與植物學性狀的遺傳多樣性分析結果較為一致。

3 討論

3.1 植物學性狀和酯酶等位酶分析在研究菘藍遺傳多樣性中的作用

遺傳多樣性（或基因多樣性）是生物多樣性的3個基本組織層次之一[18]，其可以從“形態(tài)”、“細胞”和“分子”等不同水平上切入研究，其中等位酶分析可以在大多數(shù)情況下作為遺傳標記來反映整個基因組的遺傳變異情況[17]。在形態(tài)水平方面，劉新龍等[19]采用株高等表型性狀對甘蔗（Saccharum L.）種質資源進行了遺傳多樣性分析；丁艷來等[13]結合表型性狀和SSR分子標記對中國野生大豆（Glycine soja Sieb. et Zucc.）做了遺傳多樣性分析；而在單一分子水平方面，已經(jīng)有等位酶和基于基因組的各種分子標記對遺傳多樣性進行了分析，前者在文中已有提及，后者的相關研究舉不勝舉，這里不再贅述。

由于菘藍個備良好的藥用功效以及人們保健意識的增強，使菘藍藥材的需求量日趨增大，然而各地區(qū)由于地理環(huán)境及栽培管理方式的不同，導致藥材在產(chǎn)量和質量上存在較大的差異[20]。這其中還與目前國內外缺乏一種專門用于藥用植物品種選育的理論或方法[21]有關。菘藍的藥用部位為葉片和根系，因此本研究將株高、葉面積、葉干重、根干重以及根系中的靛藍和靛玉紅含量作為重要指標進行測定，結合酯酶等位酶來全面分析了菘藍的遺傳多樣性。等位酶是同一基因位點、不同等位基因編碼的一種酶的不同形式，酶蛋白作為結構基因編碼的產(chǎn)物直接反映了DNA 鏈上堿基對的順序，其變化能較好地代表DNA分子水平的差異。等位酶的遺傳和表達遵循孟德爾定律，酶位點的不同等位基因都是等顯表達的，從酶譜上可以直接分析識別出編碼它們的等位基因，且能統(tǒng)計出等位基因頻率和基因型頻率；作為一種穩(wěn)定的基因組標志，等位酶比形態(tài)特征更能直接地反映出遺傳信息的特征，而且通過眾多位點的抽樣分析可以推斷或代表整個基因組的遺傳學特征[15]。酯酶等位酶的位點數(shù)為2～10個，相對于其他等位酶來說具有更為豐富的多態(tài)性。菘藍栽培上的品種繁多，且多為自家留種，故而用酯酶等位酶技術分析菘藍天然居群遺傳結構是可行和有效的方法。

3.2 種質資源的多樣性及所表現(xiàn)出的現(xiàn)象

通過植物學性狀指標的數(shù)據(jù)分析，結果顯示3個居群中單個居群內的表型性狀均表現(xiàn)出顯著差異，說明在生產(chǎn)上沒有把表型性狀的整齊性作為品種選擇的重要依據(jù)是正確的，也就是說生產(chǎn)上并沒有把菘藍的葉片（即大青葉）和根系（即板藍根）的產(chǎn)量作為惟一的評價指標；在某種程度上，以其療效作為重要指標參考是客觀的，而療效是以有效成分的組合及含量為基礎的。

在本研究的3個居群中，測定了根系有效成分中含量較高的2種組分靛藍和靛玉紅，結果顯示3個居群在居群內和居群間均存在顯著差異，產(chǎn)生差異的原因與植物次生代謝過程的環(huán)境有關[22]，該結果與馬莉等[23]的研究結果一致。說明目前大家雖然以療效和產(chǎn)量兼顧為生產(chǎn)目標，但是有效成分和產(chǎn)量仍是參差不齊的，規(guī)范化不足反映出在品種的選育和改進上還有較大的拓展空間。試驗得到的聚類圖也說明了這一點，在第Ⅰ、第Ⅱ、第Ⅲ這3個聚群中，各聚群的樣品數(shù)量差異較大，其中第Ⅰ聚群包含有3個居群的多個樣品。聚類圖并沒有顯示出聚群的群類與地理位置有明顯的相關性，該結果與張俊紅等[24]對光皮樺（Betula luminifera H.Winkl.）遺傳多樣性的研究結果一致。但第Ⅰ聚群中樣品來源相當豐富，這與酯酶等位酶酶譜顯示出的平均有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點比率和觀察雜合度的結果一致，也說明了3個居群的種質資源存在明顯的交流。

通過對菘藍的植物學性狀、藥用有效成分和酯酶等位酶的研究，一方面可了解到菘藍在外部形態(tài)、次生代謝產(chǎn)物和酶基因構成等層面上存在豐富的遺傳多樣性；另一方面也使我們意識到菘藍在品種選育及改良方面還需要做大量的工作。首先要明確育種目標，即藥用部位生物產(chǎn)量要適當，藥用成分種類要齊全并且含量高、組合佳、抗性強[21]；其次要建立種質資源庫，充分了解該植物在不同層面上的遺傳多樣性；第三要建立和完善新的育種方法，如通過指紋圖譜和生物效價來評價、篩選優(yōu)質資源將大大提高育種效率；最后要確定合理的種植方式、栽培技術、采收加工方法和流通途徑。

致謝： 本研究始終得到了河南科技學院實驗中心牛立元教授的關心和實驗室王青、陳仕均、張兆沛等老師的幫助， 在此表示衷心感謝。

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