武曉　張春玲　劉鳳娟

【摘要】 目的 研究Nothch1與非小細胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）關(guān)系。方法 采用免疫組化法和RT-PCR法對我院40例非小細胞肺癌患者的Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白和mRNA的表達情況進行檢測，并分析其相關(guān)性。結(jié)果 Notch1在EMT（+）組的陽性表達率明顯高于EMT（-）組，兩者在NSCLC組織中表達具有相關(guān)性。結(jié)論 Notch1可能參與了NSCLC患者的EMT過程，阻斷Notch信號通路可能會抑制NSCLC患者的EMT過程。

【關(guān)鍵詞】 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；非小細胞肺癌；Notch1

Notch1是Notch基因編碼的4種受體之一，Notch信號通路和腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系。為研究研究Nothch1與非小細胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）關(guān)系，本文采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和RT-PCR方法對非小細胞肺癌患者的Notch1指標和EMT標志物E-cadherin，Vimentin水平進行檢測，分析Notch1與EMT的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 一般資料 以2008年5月至2009年4月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科40例非小細胞肺癌（NSCLC）行肺切除患者標本為研究對象，并以20例正常肺組織為對照。40例NSCLC患者中，男性患者26例，女性患者14例，年齡42-74歲，其中鱗癌患者27例，腺癌患者13例，16例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，24例患者無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者中Ⅰ期14例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 水浴箱，紫外分光光度計，PCR儀。

1.2.2 主要試劑 鼠抗人Notch1單克隆抗體（1：50）（來源：OriGene生物科技有限公司）；鼠抗人上皮性鈣粘附蛋白單克隆抗體工作液（來源北京中杉公司）；vimtemin單克隆抗體工作液、二抗PV 6000，顯色劑二氨基聯(lián)苯氨（DAB）試劑盒（來源：北京中杉生物工程公司）；RNA提取試劑盒（來源：TaKaRa公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒（來源：Fermentas中國公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組化檢測 ①對石蠟標本進行4μm厚連續(xù)切片；②放置于60℃烤箱過夜；③采用二甲苯進行脫蠟2次，每次5分鐘；④采用梯度酒精水化，并采用蒸餾水進行沖洗；⑤采用3%過氧化氫去離子水孵育10分鐘；⑥采用蒸餾水進行沖洗，并使用EDTA微波熱修復(fù)，維持10分鐘；⑦自然冷卻至室溫后，采用PBS沖洗4次，每次1.5分鐘；⑧滴加一抗，并在37℃孵育，維持60分鐘；⑨采用PBS進行沖洗4次，每次1.5分鐘，并滴加PV 6000工作液；⑩在37℃濕盒內(nèi)進行孵育，持續(xù)20分鐘；○11采用PBS沖洗4次，每次1.5分鐘；○12采用DAB進行顯色，并采用自來水進行沖洗；○13復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.3.2 RT-PCR檢測 ①取凍存的新鮮肺組織100mg，加入Trizol提取液lml，研磨直至粉末狀，提取總RNA。②取5μl總RNA，采用2%瓊脂糖凝膠電泳對其完整性進行分析。③采用紫外分光光度計對總RNA A260nm和A280nm波長處吸光值進行分析，檢測純度和濃度。④進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應(yīng)。

1.4 判斷指標 對Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白的表達及其相關(guān)性進行評價和分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSSl7.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化法檢測Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白的表達情況 Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白在NSCLC和癌旁正常肺組織中的表達，見表1。

3 討 論

EMT在胚胎發(fā)育過程中重要的因素，研究表明，惡性腫瘤細胞在向周圍組織侵襲和向遠處器官轉(zhuǎn)移的過程中，EMT現(xiàn)象也普遍存在。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)的過程，上皮源性腫瘤細胞通過EMT過程，會導(dǎo)致極性喪失，進而導(dǎo)致細胞形態(tài)發(fā)生改變，增加其遷移能力。在這一過程中，會出現(xiàn)E-cardherin等上皮特征分子表達減少的現(xiàn)象，而vimentin等分子表達則增加。因此，對E-cardherin和vimentin分子的監(jiān)測能夠反映EMT情況。

腫瘤細胞發(fā)生EMT現(xiàn)象主要過程如下，首先出現(xiàn)“鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換”，并出現(xiàn)E-cadheri表達下調(diào)和N-cadherin表達增加現(xiàn)象，而正常上皮細胞和細胞間的黏附性則出現(xiàn)下降。研究表明，在腫瘤細胞中，EMT現(xiàn)象能夠為研究腫瘤發(fā)病機制提供參考，也為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路。

有證據(jù)顯示，在NSCLC組織中，Notch1與EMT過程相關(guān)，顯示Notch1參與了NSCLC患者的EMT過程，由此可以推斷Notch1通過Notch信號通路與多條信號通路之間存在著多條配體-受體信號通路之間的復(fù)雜對話，從而參與EMT過程，共同參與腫瘤轉(zhuǎn)移。本文對EMT的標志物檢測結(jié)果表明，E-cadherin蛋白和mRNA在NSCLC組織中的表達低于正常肺組織，40例癌組織中Notch1在EMT（+）組的陽性表達率明顯高于EMT（-）組。經(jīng)分析，兩者在NSCLC組織中表達具有相關(guān)性，證明了NSCLC中EMT的存在，且與NSCLC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

阻斷Notch1信號可能會抑制NSCLC患者的ENT，從而阻止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但Notch1參與EMT的作用機制及調(diào)控機制尚不十分明確，需要更多的研究來加以闡明。從而找到更好的治療方法。

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