郭睿等

摘要：檸檬酸是能量代謝的產(chǎn)物，只有在阻止正常代謝進行的情況下檸檬酸才可能大量積累。20世紀30年代人們已經(jīng)初步掌握了黑曲霉（Aspergillus niger）檸檬酸的發(fā)酵條件并進行規(guī)?；a(chǎn)，然而對檸檬酸積累機理的研究還不是很透徹，黑曲霉檸檬酸積累引起了眾多研究者的關(guān)注。另外，一些新的生物技術(shù)如基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也為黑曲霉檸檬酸代謝的深層研究提供了可能。綜述了黑曲霉檸檬酸代謝過程中己糖的輸送、糖酵解和能荷調(diào)節(jié)機制的研究進展。

關(guān)鍵詞：黑曲霉（Aspergillus niger）；檸檬酸積累；代謝機制

中圖分類號：TQ921+.1；TS261.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1489-04

檸檬酸（2-羥基-丙烷-1，2，3-三羧酸）最初被認為是柑橘屬植物的一種組分，作為三羧酸循環(huán)（TCA）的中間產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)近70年。檸檬酸結(jié)合低毒、可口性和美味于一體，已成為一種廣泛的食品添加劑。并且檸檬酸能夠螯合鐵、銅等重金屬離子，因此在金屬離子催化的氧化反應(yīng)過程中，對油、脂肪和抗壞血酸的穩(wěn)定性具有重要的作用，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中[1]。

目前，檸檬酸全世界消耗量已達120萬t，年產(chǎn)量達160萬t，市場貿(mào)易量為90萬t以上，且每年以7%的速度遞增。雖然檸檬酸有一小部分在酵母發(fā)酵中產(chǎn)生，但大多數(shù)發(fā)生在真菌黑曲霉（Aspergillus niger）中。數(shù)十年來，黑曲霉積累檸檬酸的生化代謝機制引起了基礎(chǔ)科學(xué)和應(yīng)用科學(xué)研究者的廣泛關(guān)注，并開展了大量研究。本文結(jié)合近些年來黑曲霉合成檸檬酸代謝機制的研究進展，對其進行總結(jié)概括，以求更深入理解其內(nèi)在機理。

1 黑曲霉合成檸檬酸的途徑

自1940年TCA學(xué)說建立以來，檸檬酸的發(fā)酵機理逐漸被人們所認識。Cleland等[2]的研究表明檸檬酸的合成過程包括葡萄糖酵解的分解代謝。由于檸檬酸合成酶位于線粒體中，合成的草酰乙酸并不立即參與檸檬酸合成酶的反應(yīng)，而是首先被細胞質(zhì)中的蘋果酸脫氫酶催化形成蘋果酸，進而通過蘋果酸-檸檬酸反向轉(zhuǎn)運進線粒體（圖1）。由圖1可知，檸檬酸是整個TCA代謝過程中的中間產(chǎn)物。在檸檬酸積累過程中，只有當黑曲霉順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低，而檸檬酸合成酶活性很高時才有利于檸檬酸的大量積累。

2 黑曲霉合成檸檬酸的代謝調(diào)控

2.1 葡萄糖的吸收

對于檸檬酸發(fā)酵，由于黑曲霉在以葡萄糖和果糖為碳源時能夠很好地生長，所以通常采用己糖為碳源。對于工業(yè)用蔗糖，一般采用在低pH條件下高溫滅菌或者利用細胞外的轉(zhuǎn)化酶水解為單糖。葡萄糖吸收主要依靠兩種親和性不同的運載體的被動擴散作用。Vankuyk等[3]發(fā)現(xiàn)了一個由mstA編碼的高親和性的運載體，碳源濃度較低時該高親和性運載體就能夠生成，它能夠催化單糖/H+交換，其Km值為25±10 μmol/L，試驗發(fā)現(xiàn)pH降低或者檸檬酸濃度升高會影響該運載體的活性。

葡萄糖達到15%（W/V）時，黑曲霉內(nèi)除高親和性運載體外，還生成一種低親和性的運載體，該低親和性運載體受pH和檸檬酸的影響比高親和性運載體要小。低親和性運載體的Km值為360 μmol/L，遠比高親和性運載體大。借助同源構(gòu)巢曲霉的基因分析發(fā)現(xiàn)，低親和力運載體可能有mstE基因編碼，mstE基因的表達隨葡萄糖濃度的升高而加強。

需要說明的是，這兩種運載體提供的是促進擴散而非主動運輸。促進擴散和主動運輸均與底物葡萄糖濃度呈非線性關(guān)系，但是簡單擴散卻是線性關(guān)系。Wayman等[4]的試驗發(fā)現(xiàn)葡萄糖的吸收率與葡萄糖濃度為簡單的線性關(guān)系而不是非線性模式。即使底物中檸檬酸的濃度很高，且這種高濃度的檸檬酸對運載體有抑制作用，但葡萄糖吸收的速率卻不受限制[5]。

2.2 糖酵解的調(diào)節(jié)

發(fā)酵初期磷酸戊糖途徑占主要部分，黑曲霉生長期間幾乎全部TCA酶的含量都很高，此時大量的葡萄糖被用于黑曲霉菌株的生長。24 h后開始有檸檬酸生成，如圖1所示，在檸檬酸發(fā)酵初期，檸檬酸通過TCA循環(huán)轉(zhuǎn)換為α-酮戊二酸。NAD-和NADP-專一性異檸檬酸脫氫酶此時具有很高的活性?？梢钥闯觯瑱幟仕岱e累的最初階段并沒有阻斷TCA循環(huán)。然而此時檸檬酸產(chǎn)量比理論值要高，這可能是氨基糖的瞬時積累及釋放所致[6]。在檸檬酸積累的誘導(dǎo)期間，延胡索酸和異檸檬酸減少，丙酮酸、草酰乙酸和檸檬酸增加。這種中間產(chǎn)物水平的短暫變化主要是因為α-酮戊二酸脫氫酶的減少，進而導(dǎo)致琥珀酸、延胡索酸的水平降低。同時由于酶解作用強烈使丙酮酸和草酰乙酸增加，這為檸檬酸的積累提供了條件[7]。

糖酵解的調(diào)節(jié)可以在不同的層面上進行：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)；利用特定效應(yīng)因子以及翻譯后修飾調(diào)節(jié)別構(gòu)酶活性[8，9]。對糖酵解調(diào)節(jié)酶基因的研究表明己糖激酶、葡糖激酶、丙酮酸激酶的合成與菌體外部環(huán)境有關(guān)，將黑曲霉置于葡萄糖和果糖碳源時能夠顯著激發(fā)轉(zhuǎn)錄過程并進而刺激這些激酶的生成。

2.2.1 己糖激酶和葡萄糖激酶 己糖的磷酸化由己糖激酶和葡萄糖激酶共同作用。但是兩種酶的基因彼此孤立，動力學(xué)決定性因素也不同。在激活的碳代謝條件下，兩種酶都可以組成型表達，只不過己糖激酶擁有更多的特異性底物。果糖可以被己糖激酶磷酸化，但是反應(yīng)很慢，在細胞中可以忽略不計。葡萄糖激酶能夠抵抗不同效應(yīng)因子的抑制，但pH稍微下降即容易被破壞。另外糖濃度低時，無論果糖還是葡萄糖均能被己糖激酶磷酸化并且沒有明顯的先后次序。己糖激酶還可以被6-磷酸海藻糖（一種海藻糖生物合成的中間產(chǎn)物）強烈抑制。但6-磷酸海藻糖只存于發(fā)酵的48 h以內(nèi)，在被cAMP依賴的蛋白激酶（PKA）磷酸化后即被中性海藻糖酶水解。6-磷酸海藻糖的水解可以使己糖激酶不再受到抑制，大量的果糖和葡萄糖被磷酸化，并可能最終促使磷酸戊糖途徑向糖酵解途徑轉(zhuǎn)變[10]。

2.2.2 磷酸果糖激酶 磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，它催化糖酵解的第一步不可逆反應(yīng)，利用Mg-ATP磷酸化果糖-6-磷酸形成果糖-1，6二磷酸并釋放副產(chǎn)物Mg-ADP。由于PFK既能保證高的糖酵解通量又能提高細胞內(nèi)檸檬酸濃度，因而受到眾多研究者的關(guān)注。

磷酸果糖激酶被正常生理濃度的檸檬酸（1～5 mmol/L）所抑制。但是在發(fā)酵條件下，這種抑制作用被許多正向效應(yīng)因子（NH4+，AMP，F(xiàn)ru-2，6-P2）所中和。碳源的濃度也可能對此有作用，這是因為處于高濃度蔗糖或者葡萄糖中的黑曲霉，其細胞內(nèi)Fru-2，6-P2（磷酸果糖激酶活化因子）濃度同樣會升高。用1-13C葡萄糖的NMR研究證實了果糖-6-磷酸為低糖條件下的主控步驟，但在高糖濃度下主控步驟下移到3-磷酸甘油醛脫氫酶[11]。

NH4+能有效解除檸檬酸和ATP對PFK的抑制。細胞內(nèi)NH4+的濃度處于生理水平時，PFK對檸檬酸不敏感。當NH4+被消耗時溶液的pH會有所下降，這對檸檬酸發(fā)酵是有利的。

最近Legi？觢a的研究發(fā)現(xiàn)PFK1翻譯后修飾會產(chǎn)生一個短的活性片段。首先通過特定蛋白酶將分子量為85 u的原蛋白水解得到無活性的49 u的片段；第二步由cAMP-依賴蛋白激酶（PKA）使蛋白分子磷酸化，從而得到短的有活性的PFK1片段[8，9]。去除具有檸檬酸結(jié)合位點的酶的C末端并保留活性N-末端部分可以使蛋白既能擁有酶的活性的同時又不受檸檬酸的抑制。與原酶相比，該活性片段被果糖-2，6-二磷酸、AMP和NH4+激活后活性更高，并且對ATP抑制作用響應(yīng)不明顯。同時為了避免復(fù)雜的翻譯后修飾自發(fā)進行，必須對活性短的PFK1片段的編碼基因進行修飾。Capuder等[12]篩選出能夠改變PFK1活性的短片段然后用谷氨酸代替相應(yīng)的蘇氨酸終止磷酸化。修飾后的基因能夠直接表達而不受檸檬酸抑制。

2.2.3 丙酮酸激酶 雖然PFK是糖酵解中最復(fù)雜的調(diào)控酶，但通常催化糖酵解的第三步不可逆反應(yīng)的丙酮酸激酶控制細胞內(nèi)糖酵解的速率。PKIA基因控制編碼丙酮酸激酶，這種酶由分子量為58 u的單體構(gòu)成。酶動力學(xué)研究進一步發(fā)現(xiàn)果糖1，6-二磷酸能夠阻止純化階段丙酮酸激酶的失活。有趣的是，對丙酮酸激酶有明顯抑制的ATP對6-磷酸-1-激酶卻沒有任何抑制，相反活性還略有提高。丙酮酸激酶一直被認為是調(diào)控檸檬酸合成階段的重要酶，但是Meixner-Monori等[13]發(fā)現(xiàn)提純后的丙酮酸激酶受到代謝程度的影響很小。并且Ruijter等[14]發(fā)現(xiàn)無論是單獨還是同時擴增PFK1和PKIA的基因，檸檬酸積累的產(chǎn)率都沒有增加。這可能驗證了Torres等[15]的計算——必須同時至少增加7個糖酵解酶的活性才能獲得較為顯著的檸檬酸積累。

2.3 能荷調(diào)節(jié)

葡萄糖進行糖酵解途徑會產(chǎn)生一定量的NADH，NADH必須及時經(jīng)過電子傳遞轉(zhuǎn)化為NAD+才能保證黑曲霉菌體內(nèi)氧化還原電位的平衡。NADH泛醌氧化還原酶全部失活時才能使檸檬酸產(chǎn)率提高。這是由于NADH失去的電子經(jīng)過呼吸鏈會產(chǎn)生ATP，過量的ATP會抑制磷酸果糖激酶的活性，不利于糖酵解的順利進行。研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了有一條正常的呼吸鏈外還有一條受水楊酸氧肟酸 （SHAM）抑制的側(cè)呼吸鏈，黑曲霉發(fā)酵后期檸檬酸的合成主要是通過側(cè)呼吸鏈完成的，缺氧會造成側(cè)呼吸鏈不可逆而失活[16]。

在檸檬酸生產(chǎn)階段，大量的NADH通過側(cè)呼吸鏈被氧化（圖2）。高活性的側(cè)鏈氧化酶將多余的NADH氧化，這樣不僅不會產(chǎn)生多余的ATP，還能夠保證細胞內(nèi)的氧化還原電位的平衡。側(cè)鏈氧化酶是在細胞質(zhì)合成后轉(zhuǎn)移到線粒體中的，Hattori等[17]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸生成時側(cè)鏈氧化酶僅由側(cè)鏈氧化酶基因（aoxl）的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。

ODonnell等[18]研究了氧壓增強時側(cè)NADH脫氫酶的作用，發(fā)現(xiàn)增加溶氧含量能夠使活性氧（ROS）濃度和抗氧化酶活性快速提高，也使細胞內(nèi)蛋白濃度下降，從而導(dǎo)致ATP下降。過量的氧環(huán)境加速了細胞的衰老和死亡。分析認為在過量溶氧條件下為了維持低濃度的ROS，側(cè)NADH脫氫酶的活性顯著增加，但是這也降低了機體合成蛋白的能力，從而無法合成足夠的ATP。

3 小結(jié)與展望

荷蘭工業(yè)化學(xué)公司DSM已經(jīng)完成了黑曲霉基因組測序的工程[19]。黑曲霉基因組約3 390萬個堿基對編碼了14 000多個基因。其中大約6 500個基因的功能已被確定。未來，黑曲霉基因組可以用于設(shè)計DNA芯片，并可用來鑒定改進菌株中表達上調(diào)和下調(diào)的基因；有助于發(fā)酵成功。另外還能夠檢測有害參數(shù)例如Mn2+或者糖濃度以及糖類型對發(fā)酵的影響。

目前國內(nèi)黑曲霉積累檸檬酸產(chǎn)量每年都有所提高，但檸檬酸生產(chǎn)時的糧耗卻居高不下，檸檬酸企業(yè)在發(fā)酵技術(shù)改造研究上的投入也相對不足，借助基因組學(xué)一些新技術(shù)深入研究黑曲霉發(fā)酵檸檬酸代謝調(diào)節(jié)，可望為培育菌株提供更好的篩選策略。

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