龐振凌　黃鵬　田亞楠

摘要：以小麥（Triticum aestivum Linn.）為材料，以不同濃度梯度的疊氮鈉溶液處理小麥葉片后，采用彗星實驗研究疊氮鈉對小麥的遺傳損傷。結果表明，疊氮鈉能引起小麥基因的損傷，并隨濃度的增加傷害程度加大，表明疊氮鈉有明顯的遺傳損傷毒性，彗星實驗可以利用植物細胞快速檢測環(huán)境中對遺傳物質有毒性的物質，是一種快速、簡單、直接檢測DNA損傷的手段。

關鍵詞：彗星實驗；疊氮鈉；小麥（Triticum aestivum Linn.）；遺傳損傷

中圖分類號：X173；S512.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1502-03

目前，致突變物的檢測是環(huán)境監(jiān)測的重要內容之一。過去大量采用微核試驗、染色體斷裂和Ames實驗，但是這些方法都是在大量煩瑣試驗的基礎上建立起來的，且花費高，不利于廣泛采用[1]。彗星實驗（Comet assay）又稱為單細胞凝膠電泳（Single cellgel elelectrophoresis，SCGE），最早由Ostling等[2]提出。彗星實驗可以定量檢測真核細胞中的多種DNA損傷，如單、雙鏈斷裂，堿性不穩(wěn)定位點，不完全切除修復位點和DNA交聯(lián)等[3]。在之前的研究中，彗星實驗多是利用動物細胞DNA的損傷檢測環(huán)境污染物質的致突變性和基因毒性，直到1996年Koppen等[4]第一次報道了利用植物為材料進行彗星實驗檢測環(huán)境污染物質對基因的損傷。此后不斷有人利用植物彗星實驗進行環(huán)境致突變物的檢測[5]，表明植物彗星實驗和動物細胞彗星實驗一樣可靠，提供了環(huán)境污染檢測的一種手段，但是對疊氮鈉遺傳損傷研究以微核居多，尚未有文獻應用疊氮鈉進行彗星實驗研究其毒性。本研究以小麥（Triticum aestivum Linn.）為材料，應用植物彗星實驗技術初步研究了疊氮鈉對小麥葉片細胞DNA的損傷，以期為慧星實驗進一步應用于植物基因毒性檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 小麥品種由南陽師范學院生命科學與技術學院遺傳學實驗室提供。

1.1.2 藥品 疊氮鈉（NaN3）、無水乙醇、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）、重鉻酸鉀（K2Cr2O7）、溴化乙錠（EB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二甲基亞砜（DMSO）、正常熔點瓊脂糖（NMA）、低熔點瓊脂糖（LMA）、TrtionX-100、纖維素酶、果膠酶、去離子水等。

1.1.3 主要儀器 Nikon熒光顯微鏡（中英昆蟲生物學聯(lián)合實驗室提供）、DYY-8C電泳儀、單面磨砂載玻片、蓋玻片（24 mm×50 mm）、移液槍及槍頭（各種規(guī)格）、離心管（各種規(guī)格）、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、手動計數(shù)器、玻璃培養(yǎng)皿、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、容量瓶、剪刀、紗布、濾紙、冰箱、吹風機等。

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片的處理和細胞核分離 采用去離子水無污染基質培養(yǎng)的小麥葉片，將其下端浸入濃度0（CK，用0.1 mol/L、PH 6.8的磷酸緩沖液浸泡）、100、500、1 000、2 000 mg/mL的NaN3溶液，于黑暗中25 ℃下處理4 h或過夜。處理結束后，取出葉片置于已在冰上預冷的無菌玻璃培養(yǎng)皿中。為避免光線對結果的影響，所有操作均在暗光或紅光燈下進行。葉片冷凍10 min后采用機械分離的方法獲得細胞核[6，7]，向培養(yǎng)皿加入一定體積的磷酸緩沖液，用無菌刀片在該緩沖液中輕輕將小麥葉片順葉脈切開并輕輕轉動培養(yǎng)皿，收集沖洗液于無菌的1.5 mL離心管中，加入2%纖維素酶和果膠酶溶液在55～65 ℃下反應約5 min，使葉片細胞核進入緩沖液獲得細胞核懸液[8]。

1.2.2 電泳膠板制作 大多數(shù)實驗常用“三明治”型3層凝膠結構，但有文獻指出3層凝膠結構容易脫落[9]，經(jīng)多次預實驗，本實驗采用2層凝膠結構。第一層為正常熔點的瓊脂糖，第二層是低熔點瓊脂糖和細胞核懸浮液的混合層。先制備第一層瓊脂糖，將用95%乙醇浸泡過夜的單面磨砂載玻片干燥后水平放于濾紙上，用移液槍及預熱至85 ℃的無菌槍頭取預熱至65～75 ℃的濃度為0.65%的正常熔點瓊脂糖100 μL于載玻片上，迅速蓋上潔凈的蓋玻片使其凝固，以獲得黏附力強、均勻一致的瓊脂糖層[10]。第一層瓊脂糖準備好以后，將其放入4 ℃冰箱中預冷，待其凝固后取下蓋玻片。取小麥葉片細胞核的懸浮液與預熱至37 ℃的1%低熔點瓊脂糖按1∶3（V/V，總體積為100 μL）混合均勻，滴在上述準備好的載玻片上，迅速蓋上潔凈的蓋玻片，再放置到4 ℃下使其凝固。

1.2.3 細胞裂解 小心移去蓋玻片，用吹風機小心垂直輕吹膠板平面，使殘余水分蒸發(fā)除去，以免裂解時膠面脫落。將載玻片置于無菌平皿中，輕輕加入預冷的新配制的細胞裂解混合液（pH>13）浸沒玻片，在常溫下裂解1 h或過夜[11]。小心取出載玻片，用去離子水輕輕漂洗2～3次，動作要求輕柔，以免膠面脫落。

1.2.4 DNA解旋 將載玻片置于水平電泳槽陽極端，并列放置，不留空隙。倒入新配制堿性電泳緩沖液覆過載玻片0.25 cm，放置20 min，使DNA變性解旋和產生，使DNA斷鏈在電場中易于遷移。

1.2.5 電泳 變性結束后在穩(wěn)壓35 V、200 mA下電泳30 min。

1.2.6 中和 電泳結束后取出玻片用去離子水沖洗3次，并用濾紙吸去多余的水分，放入無菌小玻璃培養(yǎng)皿，沿皿壁加入Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，將載玻片淹沒15 min，再將Tris-HCl吸去，用濾紙將皿內液體吸干再緩緩加入無水乙醇，將載玻片浸埋1 h，吸去乙醇，晾干或室溫下過夜。

1.2.7 染色與觀察分析 每個載玻片加入30 mg/mL的溴化乙錠溶液50 μL染色20 min后，用Nikon 熒光顯微鏡在綠激發(fā)光下觀察，用隨機軟件在自動曝光條件下用冷CCD拍照并獲取彗星圖像[12]，每張載玻片觀察25個細胞，一個處理做4張玻片，一個處理共計觀察100個細胞，計下拖尾細胞數(shù)，求出細胞拖尾率，以X2檢驗其顯著性，同時用CASP軟件分析各組平均尾長和標準差，以t檢驗檢測其顯著性，分析評價DNA的損傷程度。

2 結果與分析

2.1 不同濃度疊氮鈉溶液處理的小麥葉片彗星圖

不同濃度疊氮鈉溶液對小麥葉片DNA損傷結果如圖1所示。圖1A為對照，葉片細胞DNA基本上未發(fā)生損傷，在熒光顯微鏡下觀察，只有一個圓形的熒光頭，沒有拖尾；圖1B至圖1E為不同濃度疊氮鈉溶液處理后的彗星圖，發(fā)生了不同程度的拖尾，但因放大倍數(shù)過小圖像不甚清晰。從圖1可以看出，隨著疊氮鈉溶液的濃度逐漸增大，DNA受損也愈重，產生的斷鏈或斷片就愈多，其斷鏈或斷片也就愈小，在電場作用下遷移的DNA量愈多，遷移的距離愈長，表現(xiàn)為彗星尾長增加和彗星尾部熒光強度增強。

2.2 不同濃度疊氮鈉溶液處理的小麥葉片細胞DNA遷移效應

CASP軟件分析測定結果見表1。由表1可知，濃度為100～2 000 mg/mL的疊氮鈉溶液處理的細胞出現(xiàn)較多拖尾，拖尾率高，各處理與對照相比差異達極顯著水平。對照有7.3%細胞有拖尾現(xiàn)象，在理想條件下，對照細胞不發(fā)生拖尾現(xiàn)象，但細胞本身的狀態(tài)，以及操作中的一些細微損傷都可造成部分細胞發(fā)生拖尾，只要對照組細胞和處理組細胞其他處理條件相同，這些誤差可忽略不計，即對照細胞發(fā)生拖尾在彗星實驗允許范圍之內[13]。彗星尾長隨疊氮鈉溶液濃度的增大明顯增長，說明疊氮鈉溶液劑量越大對葉片細胞DNA的損傷越嚴重，各處理與陰性對照差異均達極顯著水平（表1）。進一步對疊氮鈉濃度（x）與彗星尾長（y）的關系進行分析，數(shù)據(jù)經(jīng)計算機曲線擬合，二者符合有截距的線性模型（圖2）：y=0.168 5x+152.8，R2=0.780 8，說明疊氮鈉對葉片細胞DNA損傷存在明顯的劑量效應關系。

3 討論

以上結果表明，疊氮鈉毒性與小麥細胞DNA損傷存在線性關系，具有明顯的遺傳損傷毒性，彗星實驗可以利用植物細胞快速檢測環(huán)境中對遺傳物質有毒性的物質，是一種快速、簡單、直接檢測DNA損傷的手段。

林愛軍等[5]利用彗星實驗研究鎘對小麥葉片的DNA傷害，初步建立了植物彗星實驗系統(tǒng)，得到了較好的結果。本研究利用疊氮鈉建立植物彗星實驗系統(tǒng)，由于實驗條件的差異，彗星實驗對各種條件的變化比較敏感，各種處理條件的變化直接影響實驗最終結果，因此本實驗參數(shù)有待進一步優(yōu)化。

采用的材料小麥是世界上總產量第二的糧食作物，也是我國主要的糧食作物之一，其質量和產量對農業(yè)生產具有重大意義，小麥的良種選育也是當前農業(yè)生產的重要問題。在遺傳良種引種工作中，對引種環(huán)境的風險評估是一項很重要的工作，環(huán)境條件直接限制良種遺傳性狀的表達，而彗星實驗對環(huán)境細微DNA損傷比較敏感，為我們進行環(huán)境檢測評估提供了一種可靠而簡便快速的方法。

植物細胞檢測系統(tǒng)的結果外推于人類時，由于植物細胞與人類細胞在結構和生化代謝各方面差距甚遠，誘變劑進入靶分子的方式及作用機理不甚相同，因此實驗研究還有待于結合相應的病理學調查。但是彗星實驗技術具有特殊優(yōu)點有著廣泛的應用前景，并且實驗所用材料屬于真核生物，更能直接推測誘變物質對人類或其他高等生物的遺傳危害，是一種比較理想的遺傳毒理學檢測方法。

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