閆海生　雷闖　馬凌霄等

摘要：通過對轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻（Oryza stativa L.）吉農(nóng)大30后代的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后代中大部分株系分離比率符合3∶1的遺傳比率，依此推斷該部分植株中插入片段的遺傳分離方式符合孟德爾遺傳規(guī)律；對轉(zhuǎn)基因植株及對照植株（吉農(nóng)大30）的農(nóng)藝性狀進行觀察比較后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的平均穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率、株高以及千粒重等性狀表現(xiàn)低于對照，但是分蘗數(shù)明顯增加，生育期延長，而且轉(zhuǎn)基因株系之間變異性較大。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza stativa L.）；轉(zhuǎn)基因；OsCYP2基因；遺傳分離比例；農(nóng)藝性狀

中圖分類號：S511 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1510-02

由于基因工程育種可以打破植物雜交的種間隔離，實現(xiàn)不同物種之間基因的轉(zhuǎn)移與整合，以獲得其他育種方法難以得到的優(yōu)良性狀，因而應(yīng)用基因工程進行育種工作具有巨大的價值。隨著轉(zhuǎn)基因方法、技術(shù)的改進，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在在育種領(lǐng)域顯現(xiàn)出越來越大的應(yīng)用前景[1]。完善的轉(zhuǎn)化技術(shù)要求外源基因能夠在轉(zhuǎn)化體及其后代中得到穩(wěn)定、高效的表達，基因工程能否在創(chuàng)造新種質(zhì)、新品種方面得到成功應(yīng)用也完全取決于外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中能否保持穩(wěn)定的遺傳表達，因此開展外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中遺傳表達的穩(wěn)定性研究具有重要意義[2]。另一方面，轉(zhuǎn)化體農(nóng)藝性狀的表現(xiàn)一直是育種工作者關(guān)心的問題之一，也決定了轉(zhuǎn)基因作物能否被直接應(yīng)用。從已有的報道來看，轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株及其自交衍生后代農(nóng)藝性狀與原親本相比一般表現(xiàn)較差[3-7]。本研究以轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻（Oryza stativa L.）為材料，對其后代進行分子檢測以及農(nóng)藝性狀觀察，旨在為轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻的進一步研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻育種課題組前期獲得的轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻吉農(nóng)大30 T2代植株為材料，并以非轉(zhuǎn)基因吉農(nóng)大30為對照。

1.2 試驗方法

試驗于2011年在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院抗鹽堿水稻試驗田及吉林省白城市鎮(zhèn)賚縣鹽堿試驗田進行，分別種植轉(zhuǎn)基因水稻T2代植株及對照植株。苗期采用潮霉素進行初步篩選，水稻插秧后剪取幼嫩葉片，使用改良后的CTAB法提取DNA，采用35S啟動子特異引物組合（F：5′ATGGATTTGTAGAGAGAGAC 3′，R：5′CTAGGAGAGCTFGCCGCAGT 3′）進行擴增檢測。擴增體系為20 μL體系，引物（濃度均為10 μmol/mL）各1 μL，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，2×PCR mix 10 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行目的條帶的檢測，對陰性植株和陽性植株數(shù)量進行統(tǒng)計，并進行χ2測驗以確定其分離比例。根據(jù)檢測結(jié)果分別調(diào)查水稻生育期、株高、分蘗、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率及千粒重等農(nóng)藝性狀并與對照進行比較與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測及遺傳分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后進行檢測并拍照記錄，部分檢測結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，陽性植株的DNA經(jīng)35 S啟動子特異引物組合擴增產(chǎn)生了205 bp的目標(biāo)擴增條帶，而陰性植株中未出現(xiàn)相同條帶，說明所檢測基因片段可以傳遞到下一代植株中。統(tǒng)計陽性植株與陰性植株數(shù)量并進行χ2測驗，共檢測31個株系，其中有20個株系符合3∶1的分離規(guī)律，即有64.5%的轉(zhuǎn)基因株系陽性植株與陰性植株比例為3∶1，遺傳方式符合孟德爾遺傳，其余株系分離比與3∶1的遺傳比例不符，出現(xiàn)不同的分離比可能是由于目的基因片段插入方式、位置以及數(shù)量的不同而導(dǎo)致，其原因有待進一步驗證。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀

轉(zhuǎn)基因植株與對照植株的農(nóng)藝性狀統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1可知，轉(zhuǎn)基因植株的平均穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、株高以及千粒重等性狀表現(xiàn)均比對照差，但是分蘗數(shù)明顯增加，生育期延長，而且轉(zhuǎn)基因株系之間各性狀變異性較大，其原因可能是外源基因插入或組織培養(yǎng)導(dǎo)致變異發(fā)生。

3 小結(jié)與討論

通過對轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻后代的DNA檢測及田間農(nóng)藝性狀的觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后代中大部分株系分離比率符合3∶1的遺傳比率，依此推斷該部分植株中插入片段的遺傳分離方式符合孟德爾遺傳規(guī)律；對轉(zhuǎn)基因植株及對照植株的農(nóng)藝性狀進行比較后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的平均穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、株高以及千粒重等性狀與對照相比表現(xiàn)較差，但是分蘗數(shù)明顯增加、生育期延長，而且轉(zhuǎn)基因株系之間各性狀變異較大，推測其原因可能是由于外源基因的插入以及組織培養(yǎng)所造成。

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種中得到了極為廣泛的應(yīng)用，各種功能基因被轉(zhuǎn)入不同植株以獲得新的育種材料，并在許多領(lǐng)域取得了較大進展，在水稻抗鹽堿育種方面，曾有科學(xué)家將甜菜堿生物酶合成基因codA及betA等導(dǎo)入水稻中以獲得鹽堿抗性增強的水稻材料[8，9]，將OsCYP2等親環(huán)素類基因?qū)胨局仓曛幸栽鰪娍剐缘难芯空趶V泛開展[10]，轉(zhuǎn)基因后代中插入基因的遺傳穩(wěn)定性對于轉(zhuǎn)基因材料的育種應(yīng)用價值至關(guān)重要。一般來說，由基因槍法導(dǎo)入的外源基因插入位置及拷貝數(shù)等均存在較大的差異，難以進行控制，后代遺傳方式也較為復(fù)雜；而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入的基因拷貝數(shù)一般較少，整合位置較為固定，故其遺傳穩(wěn)定性較好。本研究中所檢測株系大部分符合孟德爾遺傳定律，也初步驗證了這一說法，進一步的驗證有待于Southern雜交等實驗的進行。

在轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀的表現(xiàn)方面，大量的試驗表明轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀在早代一般表現(xiàn)較大變異，有利變異與不利變異均較為常見，而隨著世代的增加其農(nóng)藝性狀會逐漸趨向于與原受體材料相同，究其原因一般認為是由于早代植株受到外源基因插入及組織培養(yǎng)對于受體材料遺傳物質(zhì)的平衡影響較大[11]，本試驗中的農(nóng)藝性狀觀察結(jié)果也驗證了這一說法。而對于轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻的其他特征特性則有待于進一步更為詳細的試驗研究。

參考文獻：

[1] 李書欽，余顯權(quán)，趙福勝，等.轉(zhuǎn)ipt基因雜交水稻F1的遺傳特性及其主要農(nóng)藝性狀分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（2）：8-10.

[2] 吳 剛，崔海瑞，舒慶饒，等. cry1Ab基因在轉(zhuǎn)基因“克螟稻”后代中的遺傳穩(wěn)定性及表達[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2000，8（3）：253-256.

[3] 崔海瑞，王中華，舒慶饒，等.轉(zhuǎn)Bt基因水稻克螟稻雜交轉(zhuǎn)育后代農(nóng)藝性狀的研究[J].中國水稻科學(xué)，2001，15（2）：101-106.

[4] LYNCH P T， JONES J， BLACKHALL N W， et al. The phenotypic characterisation of R2 generation transgenic rice plants under field and glasshouse conditions[J] Euphytica，1995，85：395-401.

[5] 崔海瑞，舒慶堯，項友斌，等.轉(zhuǎn)cry1A（b）基因水稻的田間表現(xiàn)[A].朱睦元，李亞南.生命科學(xué)探索與進展[C].杭州：杭州大學(xué)出版社，1998.810-816.

[6] HAYASHIMOTO A， LI Z， MURAI N， et al. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants[J]. Plant Physiol，1990，93（3）：857-863.

[7] PENG J Y， KONONOWICZ H， HODGES T K. Transgenic indica rice plants[J]. Theor Appl Genet，1992，83（6-7）：855-863.

[8] 王中華，舒慶堯，夏英武，等.基因工程在水稻改良方面的研究進展[J].生物技術(shù)通報，1999（2）：5-8.

[9] 楊有才，周清明.轉(zhuǎn)基因水稻研究進展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，29（1）：85-88.

[10] 張忠巨. 水稻側(cè)根發(fā)育基因OsCYP2的克隆和功能分析[D].杭州：浙江大學(xué)，2007.

[11] 郭建夫，黃永相，蔣世河，等. 轉(zhuǎn)基因水稻恢復(fù)系對其雜種F1主要農(nóng)藝性狀的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，19（5）：772-776.