葉笑艷 錢 方 孫 洋 牟光慶 姜淑娟

YE Xiao-yan1 QIAN Fang1 SUN Yang2 HMU Guang-qing1 JIANG Shu-juan1

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學信息科學與工程學院，遼寧 大連 116034）

(1.School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China;2.School of Information Science and Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China)

牛乳是人類最主要的乳資源，營養(yǎng)豐富，幾乎含有人體所有的必需氨基酸。在發(fā)達國家乳蛋白及其制品提供了20%～30%的食物蛋白，顯示了乳蛋白廣泛的應用前景。然而，牛乳亦給過敏體質(zhì)的特殊人群帶來麻煩[1]。0.5%～7.5%的兒童和約1%的成年人發(fā)生牛乳過敏現(xiàn)象，嚴重影響人體健康，在全球范圍內(nèi)引起廣泛關注[2]。制備低過敏乳不僅可以擴大牛乳的食用人群，而且為乳制品的多樣化生產(chǎn)提供原料。一般來說，引起食物過敏的過敏原大都來源于食物蛋白，而實際上與過敏反應相關的僅為其部分抗原決定基（數(shù)個至數(shù)十個氨基酸），即“表位”（epitope）。乳蛋白過敏表位分為連續(xù)性過敏表位（線性表位）和不連續(xù)性過敏原表位（構(gòu)象表位）。線性表位是由某些氨基酸殘基按一定順序連續(xù)排列組成的線狀序列，屬于蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)；構(gòu)象表位是由分子內(nèi)不連續(xù)的氨基酸殘基組成，屬于蛋白分子的二級或三級結(jié)構(gòu)[3,4]。線性表位的活性依賴于氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)，構(gòu)象表位的活性依賴于構(gòu)象。因此如何破壞或去除過敏表位就成為開發(fā)低過敏食品的關鍵所在[5]。

1 牛乳主要過敏蛋白組成

美國乳品科學協(xié)會委員會基于牛乳蛋白的氨基酸序列，將其分為酪蛋白和乳清蛋白。酪蛋白（casein)主要含α-酪蛋白、γ-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白；乳清蛋白（whey protein)主要含 α-乳白蛋白（α-LA)、β-乳球蛋白（β-LG)、血清白蛋白（BSA)、免疫球蛋白（LGS)等[6]。絕大多數(shù)的牛乳蛋白都潛在過敏性，目前普遍認為casein、β-LG及α-LA是主要過敏原，BSA、LGS是次要過敏原。牛乳中β-LG占乳清蛋白50%，而人乳中不含β-LG[7]。因此該蛋白被認為是牛乳中最主要的過敏原之一[8]。

β-LG分子量為18 kDa左右，等電點為5.3，由162個氨基酸殘基組成[9]。其中包括5個半胱氨酸（Cys)殘基和2個酪氨酸（Try)殘基（Trp19和Trp61)[10]，半胱氨酸中的4個殘基形成了二硫鍵（Cys106-Cys119、Cys66-Cys160)，而另1個巰基在蛋白質(zhì)的121位置上。牛乳中β-LG以非共價鍵連接成二聚體，并通過氫鍵達到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[11]。

β-LG屬于強過敏原脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（lipocalin)家族。lipocalin蛋白結(jié)構(gòu)上的重要特征就是在其N-端有不易被破壞的相似序列，19位總是色氨酸。且具有相同由重復排列的8或 10個反向平行的 β-片層組成（A、B、C、D、E、F、G、H、I)及β-桶狀結(jié)構(gòu)（A和H之間閉合結(jié)構(gòu))（圖1)[12]。其中，β-LG的41～60、102～124、149～162 表位可被 90%～100%牛乳過敏患者血清識別，被稱為主要過敏表位。另有 1～8、25～40、92～100 表位，可被58%～72%過敏患者血清識別[13,14]。有研究[15]報道，β-LG耐胃酸、耐胃蛋白酶水解，即使通過胃腸道仍保持完整的β-LG或致敏肽段，仍具有致敏性。

圖1 牛乳中β-LG的三維結(jié)構(gòu)Figure 1 Three-dimensional structure ofβ-LG inmilk

2 降低牛乳蛋白過敏性的方法

牛乳蛋白過敏性的降低主要是用物理法（熱、射線、機械震蕩等）、化學法（化學試劑）、生物法（酶法水解、發(fā)酵）等破壞蛋白質(zhì)的過敏表位[16]。

物理法中熱處理是食品加工最常用的一種方式。熱處理可使蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生共價或非共價的相互作用，導致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象或三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所產(chǎn)生的聚合物在一定程度上可掩蓋其過敏表位，從而降低其過敏性[17]。熱處理方式很多，如烘烤、蒸煮、煎炸等，對蛋白的過敏性產(chǎn)生不同影響。

化學法中糖基化在降低牛乳蛋白過敏性中得到廣泛應用[18]，是通過蛋白質(zhì)和糖類之間的美拉德反應，使乳蛋白生成結(jié)構(gòu)復雜的糖基化合物，乳蛋白中過敏線性表位和構(gòu)象表位結(jié)構(gòu)被破壞，從而降低蛋白過敏性。最常用也是研究最多的是聚乙烯乙二醇及其衍生物(PEGs）和羧甲基葡聚糖(CMD）[19]。

目前，生物法制備低過敏乳常用酶法水解和乳酸菌發(fā)酵兩種方法[20]。酶法水解反應條件溫和，不會導致營養(yǎng)損失，也不會產(chǎn)生毒理方面問題。此外，還具有時間短、酶解程度可控制，在低酶濃度下即產(chǎn)生顯著效果等優(yōu)點[21]。乳酸菌發(fā)酵不僅可以改善牛乳風味，在菌體生長過程中可產(chǎn)生新的功能水解物，是降低牛乳過敏的有效技術(shù)[22]。

3 生物法制備低過敏乳

3.1 酶法水解制備低過敏乳

酶法水解是利用一種或多種蛋白酶對蛋白質(zhì)進行限制性水解，產(chǎn)生小分子肽和氨基酸。按照酶解程度不同，可分為輕度酶解、適度酶解和深度酶解。輕度酶解和適度酶解被認為是限制性酶解，可實現(xiàn)水解度和酶解產(chǎn)物多樣化的調(diào)控，主要用于生產(chǎn)功能性蛋白或生理活性肽；深度酶解產(chǎn)物主要是小肽和氨基酸，主要用于調(diào)味品和營養(yǎng)配方[23]。不同程度酶法水解產(chǎn)物的過敏性得到不同程度的降低，近年來輕度酶解在開發(fā)低過敏食品領域得到廣泛應用。

傳統(tǒng)的食品加工方法（如物理法）對乳蛋白構(gòu)象表位破壞程度較大，而酶法水解對其線性表位破壞程度較大。酶法水解對過敏乳蛋白的作用主要有兩方面：①肽鍵斷裂，過敏線性表位減少，從而降低過敏性；②改變抗原決定簇的三級結(jié)構(gòu)，即過敏構(gòu)象表位減少，使過敏蛋白失去活性，降低過敏性[24]。不同程度酶法水解的嬰幼兒配方乳粉已上市，雖降低了乳的過敏性，但并未完全消除，對極少數(shù)人群仍存在過敏性。酶解過程中酶的種類、酶解方式、酶解程度等因素對乳蛋白過敏性的降低起著重要作用。

酶的選擇是酶法水解的關鍵，由于乳蛋白過敏原表位的廣泛存在，選酶具一定盲目性。酶解牛乳過敏蛋白的常用酶有：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶等[25]。比如，β-LG主要過敏線性表位 41～60、102～124、149～162 的氨基酸序列與胰蛋白酶（酶切位點：Arg、Lys的 C 端）、木瓜蛋白酶 (酶切位點：Gly、Val、Leu、Arg、Lys、Phe等的 C 端)和中性蛋白酶（酶切位點：Leu、Ile、Phe的C端）的酶切位點吻合。因此，這3種酶均可水解破壞β-乳球蛋白的主要過敏表位，得到低過敏產(chǎn)物。

酶解前通過熱處理使蛋白質(zhì)變性是非常重要的，熱處理后牛乳蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)展開，對蛋白酶更加敏感[26]。Kim等[27]用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶體系50℃下分別水解天然的和熱處理（100℃，10min）的2%濃縮乳清蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著酶量的增加，兩者的抗原性均降低。與天然濃縮乳清蛋白相比，熱處理的濃縮乳清蛋白抗原性更低。Lametti等[28]用胰蛋白酶或胰凝乳酶分別在55，60，65℃，中性條件下水解牛乳β-LG，從蛋白的結(jié)構(gòu)變化上闡明，蛋白酶解使多數(shù)引起抗原性因子的過敏表位減少甚至消失，最終導致水解產(chǎn)物的低過敏性。

張潔等[29]用胰蛋白酶水解乳蛋白發(fā)現(xiàn)，當水解度為4%～10%時，乳蛋白水解物的抗原性明顯降低且變化程度較小。因此，從經(jīng)濟角度考慮以水解度達到4%為指標，優(yōu)化胰蛋白酶水解條件，得到的輕度酶解產(chǎn)物作為嬰兒配方食品的原料，可降低嬰兒過敏反應的發(fā)生。Martinez等[30]用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解牛乳蛋白，將乳清蛋白和酪蛋白按照人乳比例配比，控制蛋白濃度為 4%～6%，在 pH≥6.6，30～50 ℃，2～6 h下控制水解度在4%～10%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著酶解進行，乳蛋白過敏表位被破壞并生成小分子肽，其抗原性降低約90%。

3.2 發(fā)酵法制備低過敏乳

牛乳經(jīng)過發(fā)酵后，其過敏性會大大降低甚至消失。一種可能性是發(fā)酵乳的有效成分進入機體后，調(diào)節(jié)輔助性T細胞（helper T cell,Th）中Th1和Th2免疫反應之間的平衡，從而防止過敏發(fā)生。Matsuzaki等[31]研究發(fā)現(xiàn)，牛乳過敏可能是由于Th1與Th2免疫反應的不平衡所引起的?？诜衫胰闂U菌發(fā)酵乳可抑制機體產(chǎn)生免疫球蛋白（IgE），刺激機體產(chǎn)生自然殺傷細胞（NK細胞），從而調(diào)節(jié)機體Th1和Th2免疫反應的平衡，達到防止過敏的目的。

牛乳發(fā)酵降低過敏性的另一種可能機制是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生蛋白酶，進而水解乳蛋白過敏表位[32]。針對這種機制的相關研究較多。

乳酸菌水解蛋白質(zhì)的能力差異很大，主要與菌體內(nèi)蛋白酶活性有關。存在于細胞表面的蛋白酶把蛋白質(zhì)切斷至肽，然后滲入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)蛋白酶分解成氨基酸。一般來說乳桿菌的酶活性比球菌高。研究[33]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌中呈現(xiàn)一種廣泛的肽酶活性，不僅包括肽鏈外切酶還有肽鏈內(nèi)切酶。由此可知，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶和肽酶進行乳蛋白水解，破壞乳蛋白的過敏位點可在一定程度上降低牛乳的抗原性。

Kleber等[34]篩選乳酸菌以降低脫脂牛乳和甜乳清的抗原反應，通過ELISA反應量化β-LG的抗原活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乳酸菌發(fā)酵法能有效地降低牛乳抗原活性。篩選菌株使兩種原料中β-LG抗原性分別降低70%和90%，這不僅是因為牛乳的成分不同，更重要的是不同乳酸菌釋放的蛋白酶種類和活性各有差異。

Haddad等[35]發(fā)現(xiàn)牛乳經(jīng)90～95℃熱處理10～15 min后，β-LG與酪蛋白微粒結(jié)合，再經(jīng)嗜溫和嗜熱乳酸菌或混合菌種37℃發(fā)酵，酸乳抗原性比鮮乳降低了99%以上。故熱處理和乳酸菌發(fā)酵相結(jié)合，降低牛乳蛋白抗原性的能力更強。

4 結(jié)論

牛乳是人類不可或缺的食品，其營養(yǎng)價值一直被大家所重視，同時，牛乳及乳制品又是主要過敏食品之一[36]。與傳統(tǒng)的物理法和化學法降低牛乳過敏性相比，生物法在降低其過敏性的同時，還可改變牛乳本身的風味。乳酸菌分解乳糖產(chǎn)生乳酸，及丙酮酸代謝過程中產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)（乙酸、乙醇、丁二酮和乙醛）等賦予食品典型的香味，應用前景更廣[37]。經(jīng)生物法處理的牛乳，其抗原性有很大程度下降，但卻不能完全消除，這仍舊限制著乳制品的食用人群。因此，研究工作者仍致力于牛乳過敏的應用基礎研究，為生產(chǎn)出安全、無過敏的乳制品提供理論和技術(shù)支持。

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