費(fèi) 鵬 白洪健 程述震 曹飛揚(yáng)

FEI Peng BAIHong-jian CHENG Shu-zhen CAO Fei-yang

郭 鸰 姜亦超 苑秀娟 江 巖

GUO Ling JIA Yi-chao YUAN Xiu-juan JIANG Yan

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education Food Science College,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

傳統(tǒng)研究腸道菌群的方法存在極大的局限性，純培養(yǎng)只能研究比較容易培養(yǎng)的微生物。據(jù)估計(jì)，目前腸道中能培養(yǎng)的細(xì)菌僅占腸道內(nèi)總細(xì)菌數(shù)的10%～50%[1]，所以依賴傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)不能完整準(zhǔn)確地反映微生物群落的組成情況與變化情況。16S rDNA普遍存在于在細(xì)菌中，其交錯(cuò)排列的可變區(qū)和保守區(qū)可應(yīng)用于研究細(xì)菌的種系發(fā)生學(xué)關(guān)系，在細(xì)菌鑒別和分類方面，基于16S rDNA的序列分析方法被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”[2,3]。基于16S rDNA的變性梯度凝膠電泳(denatured gra dient gel electrophoresis，DGGE)指紋圖譜技術(shù)，可以檢測到DNA片段中的單堿基變化，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究中，同時(shí)在揭示自然界微生物群落種群差異和遺傳多樣性方面也具有獨(dú)特的優(yōu)越性[4]。

食源性疾病是指通過攝食而進(jìn)入人體的有毒有害物質(zhì)（包括生物性病原體）等致病因子所造成的疾病，擾亂腸道粘膜細(xì)胞的吸收，進(jìn)而影響了腸道微生態(tài)平衡[5]。由于嬰兒免疫力低，更容易患食源性腹瀉。怎么通過改善嬰兒的飲食從而降低該類疾病的發(fā)生成為難題。近年來有文獻(xiàn)[6]報(bào)道某些益生菌可以有效的縮短一些食源性疾病的病程，減輕病癥，但這些報(bào)道只是針對(duì)某種益生菌的作用進(jìn)行研究，并沒有針對(duì)嬰兒腸道菌群的特點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)的分析，具有一定的局限性。本試驗(yàn)通過PCR-DGGE技術(shù)對(duì)嬰兒腸道菌群進(jìn)行多樣性分析，將健康嬰兒和食源性疾病嬰兒的腸道菌群進(jìn)行對(duì)比，有助于確定對(duì)食源性疾病有預(yù)防和治療作用的益生菌的種類，為嬰兒配方乳粉中益生菌種類的選擇提供了有效的研究方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

QIAamp DNA StoolMini Kit：德國 Qiagen公司；

引物合成：北京天根生化科技有限公司；

Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×PCR buffer：大連 TaKaRa公司；

瓊脂糖：美國Sigma公司；

溴化乙錠(EB)：美國Sigma公司；

無水乙醇：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

尿素：分析純，西隴化工股份有限公司；

丙烯酰胺、去離子甲酰胺、四甲基二乙胺：分析純，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；

亞甲基雙丙烯酰胺：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

過硫酸銨：天津市博迪化工有限公司；

PCR儀：Gene Amp PCR system 9700，美國 ABI公司；

電泳儀：The DCodeTM Universal Mutation Detection System，美國Bio-Rad公司；

UVP凝膠成像系統(tǒng)：GelDoc-It image system，美國 Bio-Rad公司。

1.2 研究個(gè)體情況

(1)健康嬰兒組：15例健康母親順產(chǎn)的足月健康兒，均為0～1歲，無腹瀉或其他胃腸道病史，正常喂養(yǎng)。上述對(duì)象采樣前4周內(nèi)均未服用過微生態(tài)制劑(包括酸奶)及抗生素。

(2)食源性腹瀉嬰兒組：15例食源性疾病嬰兒，均為健康母親順產(chǎn)足月兒，均為0～1歲，經(jīng)哈爾濱市兒童醫(yī)院確診為食源性疾病引起腹瀉。

上述對(duì)象采樣前4周內(nèi)均未服用過微生態(tài)制劑(包括酸奶)及抗生素。

1.3 糞便樣品采集

對(duì)所有個(gè)體采集新鮮糞便樣品。新鮮糞便采集后立即裝入?yún)捬鹾兄?GENbox anaer，Biomérieux)，置于冰上，立即送入實(shí)驗(yàn)室-80℃保藏。

1.4 糞便樣品總DNA的提取

參照QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說明提取樣品總DNA，為了提高糞便樣品中細(xì)菌細(xì)胞的裂解效率，在加入ASL(糞便裂解液)以后的水浴溫度提高為95℃。

1.5 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR

細(xì)菌通用引物 16S rDNA V3 區(qū)：BA338f（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 引物 5′端加一個(gè) 40 bp“G C”夾(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)和 UN518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTCC-3′)[7]，引物由北京天根生化科技有限公司合成。50μL PCR反應(yīng)體系：5μL總DNA作為模板，1 U Taq DNA聚合酶，0.2 mM dNTP，1μM的上下引物，10mM 10×PCR buffer(含 15 mmol/LMgCl2)，去離子無菌水補(bǔ)充體系至50μL。PCR反應(yīng)條件：92℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括變性 92℃1min，復(fù)性55℃ 30 s，延伸72℃ 1min。最后72℃ 延伸6min[8]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.6 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)變性梯度凝膠電泳（DGGE）

應(yīng)用The DCodeTM Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)電泳系統(tǒng)。DGGE變性梯度凝膠濃度為8%，變性梯度為30%～55%(7mol/L尿素和40%甲酰胺為100%變性)。電泳條件為1×TAE電泳緩沖液，60℃，20 V，電泳10 min后，70 V，18 h[9]。電泳完成后置凝膠于GeneFinder染液中染色30min，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.7 DGGE圖譜的多樣性分析

使用Quantity One（Bio-Rad）軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類和相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 食源性腹瀉嬰兒和健康嬰兒16S rDNA的DGGE圖譜

將健康嬰兒和食源性疾病嬰兒的糞便樣本16S rDNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，可以得到其樣本的DGGE圖譜，結(jié)果見圖1。

圖1 不同樣本的腸道菌群多樣性DGGE電泳圖Figure 1 DGGE profiles of intestinalmicroflora diversity from the different samples

2.2 食源性腹瀉嬰兒和健康嬰兒DGGE圖譜的分析

約200 bp的PCR產(chǎn)物在凝膠上得到分離，在DGGE電泳圖上，每一條帶代表一個(gè)或者一類細(xì)菌。DGGE（圖1）結(jié)果表明，使用16S rDNA V3區(qū)的引物得到的微生物多樣性很豐富，總共呈現(xiàn)出31個(gè)不同位置的條帶，并且不同嬰兒糞便樣本的DGGE帶譜在條帶的數(shù)量、位置及條帶的亮度上均存在著不同程度上的差異。其中，食源性腹瀉嬰兒腸道菌群的多樣性比健康嬰兒腸道菌群的多樣性低。此外，可以明顯看出健康嬰兒組和食源性腹瀉嬰兒組的最亮條帶位置也有所不同，說明兩組樣本腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌不一樣。

2.3 食源性腹瀉嬰兒和健康嬰兒的聚類和相似性分析

使用 Quantity One（Bio-Rad）軟件，采用 UPMAGA 的方法比較各個(gè)泳道之間的相似性樹狀樹（圖2），可以得出1～5、11～15、21～25 號(hào)樣本可以聚為一類，6～10、16～20、26～30 號(hào)樣本可以聚為一類。通過相似性分析（圖3）可以得出食源性疾病樣品之間的相似性較高，而健康嬰兒樣品之間有一定的相似性。但食源性疾病樣品之間的相似性更高，且兩者腸道菌群有明顯的差異。

食源性腹瀉樣品之間的相似性較高，這是由于食源性腹瀉引起腹瀉，使得個(gè)體差異消除；而健康嬰兒樣品之間有一定的相似性，但不高，是由于健康嬰兒受遺傳、環(huán)境、喂養(yǎng)方式等的影響，產(chǎn)生的個(gè)體差異。而兩類之間的差異也是食源性疾病引起腹瀉所致。

3 討論

自20世紀(jì)80年代初最先被提出DGGE技術(shù)，它是一種用于檢測DNA突變的電泳技術(shù)[10]，可反映微生物群落中數(shù)量上大于1%的優(yōu)勢(shì)種群。因此，DGGE相比于傳統(tǒng)微生物分析方法有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)，在分子微生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[11]。

圖2 不同嬰兒樣本腸道菌群UPMAGA聚類分析圖譜Figure 2 Cluster analysis of intestinalmicroflora from different infant samples by UPGMA

圖3 不同嬰兒樣本腸道菌群相似性分析Figure 3 Similarity analysis of intestinalmicroflora from different infant samples

PCR—DGGE技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人體腸道多樣性的研究當(dāng)中，人們利用這種方法研究了不同人群腸道菌群的多樣性，如糖尿病病人、肥胖人群，不同喂養(yǎng)方式和不同分娩方式嬰兒等等。然而對(duì)食源性腹瀉嬰兒腸道菌群多樣性的研究尚少。本試驗(yàn)利用PCR—DGGE等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)食源性腹瀉嬰兒和健康嬰兒的糞便樣本進(jìn)行多樣性研究，發(fā)現(xiàn)兩類樣本之間存在著明顯的差異。食源性腹瀉嬰兒的腸道菌群多樣性較健康嬰兒的低，且兩類的優(yōu)勢(shì)菌群也存在著不同。此外，食源性腹瀉嬰兒之間的腸道菌群相似性較高，兩類嬰兒之間的腸道菌群存在著明顯的差異?？梢娎肞CR—DGGE技術(shù)可以很好的分析嬰兒腸道菌群的多樣性，這也為確定嬰兒配方乳粉中益生菌種類應(yīng)用提供了研究方法，然而，要確定益生菌的種類，還要對(duì)兩類嬰兒腸道菌群的具體差異進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探索。

1 Dave M,Higgins PD,Middha S,et al.The human gutmicrobiome:current knowledge,challenges,and future directions[J].Translational Research.,2012,160(4):246～257.

2 Relman D A,Loutit JS,Schmidt TM,et al.The agent of bacillary angiomatosis.An approach to the identification of uncultured pathogens[J].N.Engl J.Med.,1990,323(23):1 573～1 580.

3 Relman D A,Schmidt TM,MacDermott R P,et al.Identification of the uncultured bacillus of Whipple's disease[J].N.Engl J.Med.,1992,327(5):293～301.

4 Muyzer G,deWaal E C,Uitterlinden A G.Profiling of complexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction～amplified genes coding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol,1993,59(3):695～700.

5 焦富勇.小兒輪狀病毒性腹瀉研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)婦幼保健分冊(cè),2002,13(1):42～45.

6 Tran H,Moreno R,Hinkle E E,et al.Effects of lactose and yeastdried milk on growth performance,fecal microbiota,and immune parameters of nursery pigs[J].J.Anim Sci.,2012,90(9):3 049～3 059.

7 Muyzer G,DeWaal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol.，1993,59(3):695～700.

8 Maria Befring Hovda,Bjφrn Tore Lunestad,Ramon Fontanillas,et al.Molecular characterisation of the intestinalmicrobiota of farmed Atlantic salmon(Salmo salar L.)[J].Aquaculture,2007,273(1～4):581～588.

9 Maria Befring Hovda,Morten Sivertsvik,Bjφrn Tore Lunestad,et al.Characterisation of the dominant bacterial population inmodified atmosphere packaged farmed halibut (Hippoglossus hippoglossus)based on 16S rDNA-DGGE[J].Food Microbiology,2007,24(1～4):362～371.

10 Fischer SG,Lerman L S.DNA fragments differing by single basepair substitutions are separated in denaturing gradient gels:correspondence with melting theory[J].Proc Natl Acad Sci.USA,1983,80(6):1 579～1 583.

11 Ferguson A S,Huang W E,Lawson K A,et al.Microbial analysis of soil and groundwater from a gasworks site and comparison with a sequenced biological reactive barrier remediation process[J].J.Appl Microbiol.，2007,102(5):1 227～1 238.