董秋艷 韓 濤 王磊峰 董玉萍 劉 瑩 王 博

非酒精性脂肪性肝病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷[1]。NAFLD在世界范圍內(nèi)平均患病率為20%～33%[2]。胸腺素β4（Thymosinβ4,Tβ4）是個高度保守的、由43個氨基酸殘基組成的多肽，分子質(zhì)量約為4 963 u。它參與人體內(nèi)多種生物學(xué)過程，促進創(chuàng)傷愈合和上調(diào)炎性因子，在細胞分化和增殖方面起重要作用[3-4]。而NAFLD時血清Tβ4的水平如何尚少見報道。本研究旨在初步探討血清Tβ4與NAFLD的關(guān)系，為臨床診治NAFLD提供新的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年4月—2011年3月在天津市第三中心醫(yī)院門診治療的NAFLD患者40例，其中男29例，女11例，年齡（43.14±15.19）歲，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2010年制定的非酒精性脂肪性肝病診療指南[2]。其中26例參與多中心隨機雙盲實驗研究的患者采用水飛薊賓或多烯磷脂酰膽堿治療，療程均達到6個月，觀察非酒精性脂肪性肝病臨床療效并行安全性評價。隨機抽取同期健康體檢肝臟超聲正常者40例作為對照組，其中男33例，女7例，年齡（42.23±10.65)歲。2組性別（χ2=1.147）和年齡（t=1.196）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。

1.2 血樣采集 入選對象均于清晨采取空腹靜脈血3 mL，注入不含抗凝劑帶分離膠的生化管中，于2 h內(nèi)以3 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-80℃冰箱保存待測。

1.3 檢測方法 ⑴血清Tβ4濃度的測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（K9520，Immunodiagnostik AG,Bensheim,Germa?ny）進行檢測。⑵采用全自動生化分析儀對患者血清中三酰甘油(TG)、總膽固醇（CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶線粒體同工酶(ASTm)、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、空腹血糖(FPG)等指標進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差(x± s)表示,2組間的比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方（χ2）檢驗。診斷實驗的靈敏度、特異度及AUC采用ROC曲線，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組生化指標的比較 NAFLD組患者血清中TG、ALT、ASTm、GGT、TBIL、ALP、ALB、FPG與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01）,其他生化指標2組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見表1。

2.2 2組血清Tβ4水平的比較 NAFLD組血清Tβ4為(2.635 4±2.633 1)mg/L，對照組為(9.282 7±4.663 5)mg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.241，P＜0.01）。

Table 1 Comparison of biochemical parameters between two groups表1 2組生化指標的比較(n=40,x±s)

2.3 治療前后各項生化指標的比較 NAFLD組患者治療后血清中 TG、ALT、ASTm、GGT、TBIL、ALP、ALB、FPG與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01）,其他生化指標2組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

Table 2 Comparison of biochemical parameters before and after treatment in 26 patients with NAFLD表2 26例NAFLD患者治療前后生化指標的比較(n=26,±s)x

2.4 治療前后血清Tβ4水平的比較 26例NAFD患者血清Tβ4的水平治療后(3.7434±1.8871)mg/L,高于治療前的(2.085 4±1.150 5)mg/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.486，P＜0.01）。

2.5 血清ALT、Tβ4水平的ROC曲線圖 以B超作為NAFLD診斷的金標準，分別做出血清ALT、Tβ4水平的ROC曲線圖。在血清ALT水平的曲線上取靈敏度+特異度之和最大值點（40.10 U/L）作為預(yù)測NAFLD的cut-off值，AUC為0.717（95%CI為0.596~0.838），靈敏度為57.5%，特異度76.7%；以靈敏度+特異度之和最大值點的血清Tβ4值（4.830 5 mg/L）作為預(yù)測NAFLD的cut-off值，AUC為0.906（95%CI為0.842~0.969），靈敏度為85%，特異度80%；血清Tβ4的AUC明顯大于ALT，血清Tβ4的靈敏度、特異度均顯著高于ALT，見圖1。

圖1 血清ALT、Tβ4水平的ROC曲線圖

2.6 NAFLD組患者血清Tβ4水平與肝功能指標的相關(guān)性 NAFLD組患者血清Tβ4水平與其血清ALT含量呈負相關(guān)（r=-0.330，P＜0.05）。

3 討論

NAFLD是導(dǎo)致肝功能異常的主要原因[5]。疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）,非酒精性單純性脂肪性肝炎（NASH）及其相關(guān)肝硬化、肝細胞癌[5-6]和亞急性肝功能衰竭[7]。Day等[8]提出NAFLD存在二次打擊的發(fā)病機制,“第一次打擊”是脂肪積聚和脂肪變性；而氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化、炎癥性細胞因子的釋放、線粒體功能異常等因素形成“二次打擊”,誘導(dǎo)了肝臟炎癥反應(yīng)、肝脂肪變性、肝細胞損傷、炎癥和纖維化。其發(fā)病機制至今尚未完全明確,越來越多的證據(jù)表明脂肪酸代謝紊亂是NAFLD發(fā)生的基礎(chǔ)[9]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-線粒體功能障礙在NAFLD“二次打擊”的病理生理中起著關(guān)鍵性作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NAFLD患者血清Tβ4的水平明顯降低，說明盡管NAFLD患者的ALT、AST升高的水平并不明顯，但其肝臟功能的損傷程度是十分嚴重的。在臨床上,當NAFLD患者的肝臟作為供肝來源進行肝移植時，雖然肝功能的各項指標在正常范圍內(nèi)，但最終會導(dǎo)致移植肝受體失功。因此，NAFLD患者血清Tβ4的水平可能會更好地反映肝臟的功能。本研究中血清ALT、Tβ4水平的ROC曲線圖顯示：血清Tβ4水平的靈敏度與特異度明顯高于血清ALT水平。NAFLD患者出現(xiàn)肝功能不良的原因是和其發(fā)病機制密切相關(guān)的:當發(fā)生NAFLD，出現(xiàn)脂肪酸過載且線粒體脂肪酸氧化障礙時，未被氧化的脂肪酸不斷酯化生成三酰甘油，沉積于肝細胞內(nèi),導(dǎo)致肝細胞脂肪變性。肝臟脂肪的異常積聚和脂肪變性，會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能的異常，進一步加重氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，引起惡性循環(huán)，使NAFLD患者的肝細胞功能嚴重受損。

有研究表明，Tβ4能降低氧自由基水平，減緩脂質(zhì)過氧化，抑制炎性細胞因子的生成[10]，并促進細胞再生[4]，與創(chuàng)傷愈合[3]、細胞凋亡[4]、炎癥反應(yīng)[11]、血管生成[12]等均有密切關(guān)系。本研究對接受水飛薊賓或多烯磷脂酰膽堿治療的26例NAFLD患者血清Tβ4水平進行比較發(fā)現(xiàn):治療后隨著臨床癥狀的緩解和各項實驗室指標的改善，血清Tβ4水平明顯升高?？紤]其原因可能是在NAFLD疾病的進程中，持續(xù)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致了肝細胞的損傷，使血清Tβ4水平降低。水飛薊賓或多烯磷脂酰膽堿具有穩(wěn)定細胞膜、保護肝細胞酶系統(tǒng)、清除肝細胞內(nèi)的活性氧自由基的作用；同時還可改善肝細胞脂肪變性，阻止或減輕在肝臟內(nèi)的沉積和浸潤，并具有抗炎免疫調(diào)節(jié)及降血脂的作用,使NAFLD患者癥狀、肝功能及肝組織學(xué)明顯改善,從而降低NAFLD患者ALT水平，最終致使血清Tβ4的水平升高。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，26例NAFLD患者接受水飛薊賓或多烯磷脂酰膽堿治療后的血清ALB比治療前降低，推測其原因可能是NAFLD患者在治療過程中，經(jīng)過控制飲食、有效鍛煉，以及考慮到血清白蛋白半衰期相對較長等原因，最終使患者治療后的血清ALB下降。

本研究通過ELISA法檢測了NAFLD患者血清Tβ4的水平，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清Tβ4濃度低于健康人，且經(jīng)過有效治療后明顯升高，血清Tβ4的水平比ALT更靈敏地反映NAFLD患者的肝臟功能。其具體作用機制尚需進一步探討，同時需要增加治療隨訪例數(shù)，延長觀察時間及結(jié)合組織學(xué)資料進一步評價其價值。

[1]Fan JG,Farrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liver dis?ease in China[J].J Hepatol,2009,50(1):204-210.

[2]中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精肝病組.非酒精性肝病診療指南[J].中華肝臟病雜志，2010,18(3):163-166.

[3]Philp D,Badamchian M,Scheremeta B,et al.Thymosin beta 4 and a synthetic peptide containing its actin-binding domain promote dermal wound repaire in db/db diabetic mice and in aged mice[J].Wound Repair Regen,2003,11（1）:19-24.

[4]Bock-Marqutte I,Saxena A,White MD,et al.Thy mosin beta 4 acti?vates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration,survival and cardiac repair[J].Nature,2004,432(7016):466-472.

[5]Farrell GC,Larter CZ.Nonalcoholic fatty liver disease:from steato?sis to cirrhosis[J].Hepatology,2006,43(2 Suppl 1):S99-S112.

[6]de Alwis NM,Day CP.Non-alcoholic fatty liver disease:the mist gradually clears[J].J Hepatol,2008,48（Suppl 1）:S104-S112.

[7]Patrick-Melin AJ,Kalinski MI,Kelly KR,et al.Nonalcoholic fatty liver disease:biochemical and therapeutic considerations[J].Ukr Biokhim Zh,2009,81(5):16-25.

[8]Day CP,James OF.Steatohepatitis：a tale of two“ hits”[J]?Gastro enterology,1998,114(4)：842-845.

[9]Geoffrey GC,Larter CZ.No nalcoholic fatty liver disease from steato?sis to cirrhosis[J].Hepatology,2006,43(2):S99-S112.

[10]Badamchian M,Damavandy AA,Damavandy H,et al.Identification and quantification of thymosin beta 4 in human saliva and tears[J].Ann NY Acad Sci，2007，1112:458-465.

[11]Sosne G,Qiu P,Christopherson PL,et al.Thymosin beta 4 suppres?sion of corneal NFkappaB:a potential anti-inflammatory pathway[J].Exp Eye Res,2007,84(4):663-669.

[12]Cha HJ,Jeong MJ,Kleinman HK.Role of thymosin beta4 in tu mor metastasis and angiogenesis[J].J Natl Cancer Inst,2003,95(22):1674-1680.