郝玉英 菅艷艷 石妍 邱愛梅 楊永利 楊常敏

活血膠囊質量標準的研究

郝玉英 菅艷艷 石妍 邱愛梅 楊永利 楊常敏

目的建立包頭市中心醫(yī)院臨床驗方中藥制劑活血膠囊的質量標準。方法采用薄層色譜法，對活血膠囊中紅花、黃芪、川芎進行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定羥基紅花黃色素A含量。色譜柱采用Agilent TC-C18柱（150mm ×4.6mm，5μm）；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72）為流動相；檢測波長為403.0nm。結果檢測的結果是羥基紅花黃色素A呈良好的線性關系，條件是在0.1372～0.9601μg范圍內，r=1，平均回收率99.0%，RSD=0.8%（n=6）。結論該方法簡便、準確、可靠，可作為活血膠囊的質量控制方法。

活血膠囊；質量標準；TLC；HPLC；羥基紅花黃色素A

活血膠囊是我院多年使用的臨床驗方，由川芎、紅花、黃芪等8位藥物組成；具有破血逐瘀，通竅止痛的功效。臨床上主要用于治療腦梗塞后循環(huán)缺血、腦供血不足、周圍神經病變、神經損傷等疾病引起的半身不遂、言語不利、口眼歪斜、肢體麻木等癥。為控制活血膠囊的質量，采用了薄層色譜法對該制劑中的川芎、紅花、黃芪進行了定性鑒別；對制劑中的羥基紅花黃色素A進行含量測定時采用的是高效液相色譜法從而有效的控制了活血膠囊的質量。

1 定性鑒別

本品為藥材粉末和提取物制成的膠囊，方中紅花和黃芪的顯微特征都比較明顯，故建立顯微鑒別，并對處方中的川芎、紅花、黃芪建立了薄層鑒別。

1.1 儀器與試藥由本院提供（批號：20111227、20120128、20120324），模擬樣品為自制。川芎對照藥材（批號：120918-201110）：中國藥品生物制品檢定研究院購買。紅花對照藥材（批號：120907-200609）：中國藥品生物制品檢定研究院購買。黃芪對照藥材（批號：120974-200609）：中國藥品生物制品檢定研究院購買。硅膠G（薄層色譜用）：青島海洋化工廠生產。鋪板器（939型薄層鋪板器）：重慶貝可得公司生產。薄層板：為包頭市食品藥品檢驗檢測中心自制。試劑：薄層色譜鑒別所用試劑均為分析純。

1.2 顯微鑒別正文中各鑒別特征所代表的藥材分別為：纖維成束或散離，直徑8～30μm，壁厚，表面有縱裂紋，初生壁常與次生壁分離，兩端常斷裂成須狀，或較平截（黃芪）。花粉粒類圓形、橢圓形或橄欖形，直徑約至60μm，具3個萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起（紅花）。

1.3 薄層鑒別

1.3.1 川芎的鑒別取本品粉末10g，加乙醚50ml，通過1h的加熱回流，進行過濾，將濾液揮發(fā)掉，剩余的殘渣中加入2ml乙醚使其溶解，所得液體作為試品溶液。另外取出1g川芎對照藥材，通過同樣的方法得到溶液。在試驗時使用薄層色譜法，取10μl上述兩種溶液，分別將這兩種液體點在同一硅膠GF254薄層板上，展開劑使用己烷-乙酸乙酯(3：1)，后取出并晾干，放在外光燈(254nm)下檢視，最后放在供試品色譜中，能夠在色譜上相應的位置上出現熒光斑點（圖1）。

1.3.2 紅花的鑒別取本品粉末10g，加80%丙酮溶液20ml，密塞，超聲處理20min，濾過，作為供試品溶液。同時取出0.5g紅花對照藥材，用同樣的方法制成對照藥材溶液。通過薄層色譜法進行試驗，將上述兩種液體分別取出10μl，同時將兩種液體分別在同一硅膠G薄層板上進行點滴，展開劑使用乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)，后取出并晾干。在供試品色譜中能夠顯出相同顏色的斑點（圖2）。

圖1 活血膠囊中川芎的薄層色譜鑒別方法學研究圖

圖2 活血膠囊中紅花的薄層色譜鑒別方法學研究圖

1.3.3 黃芪的鑒別取出5g黃芪粉末，加入30ml乙醚，通過20min的加熱回流，進行濾過之后得到殘渣，殘渣加0.3%氫氧化鈉溶液15ml使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調節(jié)pH值至5～6，用乙酸乙酯15ml振搖提取，分取乙酸乙酯液，用濾紙將溶液濾過，濾紙上要鋪上適量的無水硫酸鈉，將濾液蒸干。所得殘渣中加入1ml乙酯讓殘渣溶解，所得液體作為供試品溶液。取出1g黃芪作為對照藥材，同樣的方法制成對照藥材溶液。通過薄層色譜法進行試驗，取出10μl上述兩種液體，將它們點在同一硅膠G薄層板上，展開劑使用三氯甲烷-甲醇(10：1)，將液體展開之后取出晾干，放在氨蒸氣中熏后，再放在紫外光燈下進行檢視。這時，在供應品色譜中，對照的位置上能夠顯出同樣顏色的熒光性斑點（圖3）。

圖3 活血膠囊中黃芪的薄層色譜鑒別方法學研究圖

2 羥基紅花黃色素A的含量測定

本品為川芎、紅花、黃芪等8味藥組成的復方制劑。文獻報道紅花主要含黃酮類化合物、脂肪酸、色素、揮發(fā)油及多炔等化合物。通過《中國藥典》中對紅花含量的測定方法，對羥基紅花黃色素A含量測定時采用HPLC法。經過特定的分析方法進行驗證，能夠看出此法具有較好的重現性，同時有著較強的專屬性，不會干擾其它組分對羥基紅花黃色素A的測定，所以可以納入質量標準之中。

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器島津LC-10ATvp泵，SPD-10Avp型檢測器，島津CLASS-VP工作站，Sartorious BP211D型電子天平。UV-1100型紫外分光光度儀（北京瑞利分析儀器公司）。

2.1.2 試劑與試藥用羥基紅花黃色素A作為試劑（111637-200905，含量以91.8%計，供含量測定用）：從中國藥品生物制品檢定研究院購買；活血膠囊（批號：20111227、20120128、20120324）由包頭市中心醫(yī)院提供；模擬樣（20120328）自制；色譜純使用乙腈、甲醇，水為高純水，分析純使用其他試劑。

2.2 方法學考察

2.2.1 色譜條件

2.2.1.1 色譜拉把十八烷基硅烷鍵合硅膠作為色譜柱填充劑，采用AgilentTC-C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）作為本實驗研究。

2.2.1.2 流動相的選擇對羥基紅花黃色素A選擇的測定方法采用流動相的形式，對流動相進行流動相條件摸索以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72），在結果供試品色譜中的羥基紅花黃色素A具有較好的分離度，同時有著較高的理論板數，并且能夠長時間保存，所以作為檢測的流動相。

2.2.1.3 柱溫室溫。

2.2.1.4 檢測波長的選擇取羥基紅花黃色素A對照品適量，使用25%甲醇，制作成1ml含40μg的溶液，在300～500nm波長范圍掃描。得出羥基紅花黃色素A在403.0nm處有最吸收。在檢測時參照中國藥典2005年版一部“紅花”含量測定項下羥基紅花黃色素A的測定方法，檢測波長選擇403.0nm進行。

2.2.1.5 理論板數的確定根據多批檢測數據中可以看出，要想羥基紅花黃色素A得到較好的分離效果，理論板數在4000以上即可。但由于不同的色譜柱具有不同的理論板數，故確定理論板數按羥基紅花黃色素A峰計算應不低于3000。

2.2.2 溶劑提取及提取效率的考察

2.2.2.1 選擇提取溶劑測定方法可以參照《中國藥典》2010年版一部“紅花”項下的羥基紅花黃色素A中含量的測定，提取劑為25%的甲醇。

2.2.2.2 考察提取效率提取劑為25%的甲醇50ml進行超聲提取，采用超聲法提取，為確保將被測成分完全提取出來，選取30min、40min和50min不同的提取時間來考察對提取效率的影響（見表1）。

表1 提取效率試驗

從表中數據可見，超聲處理30min、40min和50min羥基紅花黃色素A的含量基本一致，故超聲提取時間定為40min。

2.2.2.3 提取溶劑加入量考察在特定的提取過程中，考察溶劑的加入量，結果見表2。

表2 提取完全試驗的考察表

從表中數據可見，用25ml溶劑的樣品羥基紅花黃色素A含量較低，用50ml和75ml溶劑的樣品羥基紅花黃色素A含量基本一致，提取完全，所以確定提取溶劑加入量為50ml。

2.2.3 專屬性陰性對照試驗：在制備供試品溶液和對照品溶液的時候按照《中國藥典》2010年版一部“紅花”項下的羥基紅花黃色素A【含量測定】項下的方法制備。制備的缺紅花的陰性對照供試品按照相應的處方比例采用相同的工藝，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。在上述色譜的條件下，精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各20ml，分別注入液相色譜儀，得出陰性對照色譜圖和羥基紅花黃色素A對照品以及供試品色譜圖在相對應的保留時間處無色譜峰出現，表明其他組分對羥基紅花黃色素A的測定無干擾（見圖4～6）。

圖4 陰性樣品圖

圖5 羥基紅花黃色素A對照品樣品圖

圖6 活血膠囊樣品圖

2.2.4 線性關系考察精密稱取出適量的取羥基紅花黃色素A對照品適量，加入甲醇（濃度為25%）制成1ml含0.6mg的溶液作為對照品溶液；精密量取上述對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，置于10ml容器瓶加入甲醇至刻度，搖均勻。取10μl液體至色譜儀進行測定，得出羥基紅花黃色素A在0.1372～0.9601μg范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為Y=14930+32464X，r=1（見表3）。

表3 羥基紅花黃色素A的標準曲線

2.2.5 穩(wěn)定性試驗選取同一份供試品溶液，分別在0h、2h、4h、、8h、12h進行測定，結果見表4。

表4 不同時間測定樣品中羥基紅花黃色素A的峰面積積分值

從表中的數據可以看出，在12h內羥基紅花黃色素A的峰面積積分值基本穩(wěn)定不變。

2.2.6 精密度選取樣品（批號：20111227），研細，取6份，按照《中國藥典》2010年版一部“紅花”項下的羥基紅花黃色素A項下的方法操作，測定每份樣品的含量（見表5）。

表5 羥基紅花黃色素A含量重復性試驗結果

2.2.7 準確度精密稱定實驗供試品（含量0.07mg/粒)9份，每份約1.5g，分別置9個具塞錐形瓶中，同時分為三組，每組為三份，加入濃度為0.4284 mg/ml的羥基紅花黃色素A溶液，容量分別為1ml、1.2ml、1.5ml（約相當于供試品含有量的80.0%、100%、120%），同時加入25%的甲醇溶液各50ml，總體積為51.0ml、51.2ml和51.5ml，測定每份含量，計算回收率，具體結果見表6。

3 樣品含量測定

采用相應的含量測定法方測出樣品含量，三批樣品（批號：20111227、20120128、20120324）和一批模擬樣品（20120328）的測定結果見表7。

從表7中三批樣品和一批模擬樣品測定的數據可見，羥基紅花黃色素A的含量在0.07mg/粒以上，考慮到藥材質量差異，下浮10%，暫定本品每1g含紅花以羥基紅花黃色素A。

表6 加樣回收率測定結果

表7 樣品中羥基紅花黃色素A含量測定結果

4 小結

該方法簡便、準確、可靠、可作為活血膠囊的質量控制方法。

[1] 肖培根,李大鵬,楊世林,等.新編中藥志[M].北京：化學工業(yè)出版社, 2001.

[2] 呂武清,龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1996：232-237.

[3] 劉紅訓.中藥材薄層色譜鑒別[M].天津：科學技術出版社,1989.

[4] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會編.中華本草?蒙藥卷[M].上?？茖W技術出版社,2004.

[5] 趙文達.常用中藥材組織粉末圖解[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1991.

[6] 徐國鈞.中藥材粉末顯微鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1986.

[7] 內蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳編.內蒙古蒙藥材標準[M].赤峰：內蒙古科學技術出版社,1987.

[8] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2005年版一部[M].北京：化學工業(yè)出版社,2005.

R286.0

A

1673-5846（2013）01-0039-04

包頭市中心醫(yī)院門診藥房，內蒙包頭 014040