張曉燕 楊更亮

一種新型硅膠雜化整體柱的制備及其對(duì)免疫球蛋白分離的影響

張曉燕1楊更亮2

新型雜化硅膠整體柱；制備；蛋白分離

本文以乙烯基三乙氧基硅烷（VTES）和四甲氧基硅烷（TMOS）為反應(yīng)前體，經(jīng)過(guò)醋酸水解后，與有機(jī)單體甲基丙烯酸甲酯（MMA）進(jìn)行縮合制備了有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠整體柱。最后將制備好的整體柱用于人血中免疫球蛋白的分離，得到了較好的分離效果。

1 概述

近年來(lái)，高效液相色譜因其高效，快速分離的特點(diǎn)逐漸成為了分離分析的主要手段，而色譜柱作為整個(gè)色譜分離系統(tǒng)的中心，也越來(lái)越成為眾多學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，并廣泛的應(yīng)用在高效液相色譜、固相萃取中。

由于整體柱具有制備簡(jiǎn)單、高通透性、良好的分離效率和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)已逐漸進(jìn)入了人們的視野。整體柱按其材質(zhì)可分為三類：無(wú)機(jī)介質(zhì)整體柱、有機(jī)聚合物整體柱及雜化整體柱。但是無(wú)機(jī)硅膠基質(zhì)整體柱中的Si-O-C鍵不耐酸堿，且通過(guò)改性在表面引入功能團(tuán)的過(guò)程比較復(fù)雜，重復(fù)性也不太理想。有機(jī)聚合物整體柱雖然耐酸堿性好，但其受溫度和有機(jī)溶劑的影響會(huì)出現(xiàn)溶脹，從而影響整體柱的穩(wěn)定性和機(jī)械性能[1]。因此，發(fā)展新型整體柱材料是目前色譜領(lǐng)域中非常重要的課題之一。有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱因具有高機(jī)械性能，延長(zhǎng)壽命以及良好的生物相容性得到了越來(lái)越多科研工作者的關(guān)注[2]。

本文以VTES和TMOS為反應(yīng)前體，經(jīng)醋酸水解再與MMA進(jìn)行縮合制備雜化整體柱，并考察了免疫球蛋白（IgG）在整體柱上的保留行為，取得了較好的分離效果。

2 試驗(yàn)

2.1 試劑乙烯基三乙氧基硅烷（VTES，江蘇省儀征市天楊化工廠），四甲氧基硅烷（TMOS，江蘇省儀征市天楊化工廠），甲基丙烯酸甲酯（MMA，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，上海盛達(dá)鑫化工），偶氮二異丁基腈（AIBN），上海盛達(dá)鑫化工），十二醇（天津市精細(xì)化工研究所），免疫球蛋白（IgG，龐博生物）。其它試劑均為分析純，所有溶液及流動(dòng)相進(jìn)入色譜系統(tǒng)前均經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.2 雜化整體柱的制備

2.2.1 雜化整體柱Ma的制備將0.1mL VTES、0.3mL TMOS和0.2mL HAC加入到干燥潔凈的試管中，放在磁力攪拌器上水解1h，使得VTES和TMOS充分水解，然后將0.3mL MMA，0.2mL EDMA，0.02g AIBN，1mL十二醇加入到反應(yīng)液中，置于超聲清洗器中0.5h使其完全混勻。將混合好的液體倒入干燥潔凈的不銹鋼空柱管中，兩端密封。放于恒溫水浴箱，于60℃反應(yīng)24h使聚合。將制備好的整體柱用甲醇以0.1mL/min的流速?zèng)_洗12h，將致孔劑和其它可溶性化合物沖出。

2.2.2 有機(jī)聚合物整體柱Mb的制備將0.3mL MMA，0.2mL EDMA，0.02g AIBN，1mL十二醇加入到干燥潔凈的試管中，同上條件進(jìn)行制備。

2.3 整體柱的色譜性能

2.3.1 色譜條件流動(dòng)相A：水流動(dòng)相B：0.02molL-1Na2HPO4流動(dòng)相C：0.2molL-1Na2HPO4，波長(zhǎng)280nm；流速1.0mL/min。

2.3.2 蛋白分離取健康人血，經(jīng)低溫（4℃）高速離心（10000 rpm），取上清液進(jìn)樣，色譜梯度為0～2min為水，2～4min為0.02molL-1Na2HPO4，4～8min為0.2molL-1Na2HPO4。

3 結(jié)果

3.1 人血中免疫球蛋白的分離圖1為整體柱對(duì)人血中免疫球蛋白的分離，Mc、Me分別為Mc和Me整體柱，在Mc中有三個(gè)峰，中間的為IgG，在Me中只有一個(gè)峰，說(shuō)明Me整體柱對(duì)IgG沒(méi)有分離能力。這是因?yàn)?，Mc為有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱，具有合適的孔結(jié)構(gòu)，而Me為傳統(tǒng)的有機(jī)聚合物整體柱，沒(méi)有適合分離IgG的孔結(jié)構(gòu)。

圖1 IgG的色譜分離圖

3.2 流動(dòng)相濃度對(duì)免疫球蛋白分離的影響本文考察不同濃度流動(dòng)相（0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2molL-1）對(duì)IgG分離的影響，隨著緩沖鹽濃度的增加，對(duì)IgG的洗脫能力逐漸增強(qiáng)。這一現(xiàn)象是由于靜電效應(yīng)引起的。隨著鹽濃度的增加，離子強(qiáng)度也逐漸增加，從而降低了IgG和整體柱之間的靜電吸引，使得被洗脫的IgG增多。

3.3 流動(dòng)相PH值對(duì)免疫球蛋白分離的影響另外本文也考察了不同PH值（PH5.6.7.8.9）的流動(dòng)相對(duì)IgG洗脫能力的影響，當(dāng)PH=6.0時(shí)，免疫球蛋白洗脫量最大，而其它PH條件下，洗脫量明顯減小。這是由于免疫球蛋白的等電點(diǎn)是5.5～7.5，蛋白在其等電點(diǎn)處不帶電荷，就可以與疏水性的柱子發(fā)生作用，所以蛋白的最大吸附應(yīng)該出現(xiàn)在其等電點(diǎn)處。該分離現(xiàn)象也符合疏水色譜分離原理。

4 結(jié)論

本位以VTES和TMOS為前體，以MMA為有機(jī)單體制備了有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化整體柱，該整體柱具有良好的通透性，穩(wěn)定性和均勻的孔結(jié)構(gòu)，將該整體柱應(yīng)用與人血中免疫球蛋白的分離，取得了較好的結(jié)果。

[1] 程佳.一種新型雜化聚合物整體柱的制備及其在蛋白分離方面的應(yīng)用[D].河北大學(xué),2011.

[2] 嚴(yán)麗娟,張慶合,李彤,等.有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化硅膠基質(zhì)整體柱的制備及其電色譜性能[J].色譜,2005(5)：499-503.

R917;TQ028.8

A

1673-5846(2013)01-0235-02

1 河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定 071002

2 河北省藥物質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002