楊尊　劉婷　鄭鴻等

[摘要] 目的 轉(zhuǎn)染猿腎病毒SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊細(xì)胞，獲取具有無限增殖能力和穩(wěn)定生物學(xué)性狀的牙囊細(xì)胞用于牙周組織工程的研究。方法 利用293細(xì)胞包裝病毒構(gòu)建含SV40Tag的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒并轉(zhuǎn)染至SD大鼠牙囊細(xì)胞。以正常牙囊細(xì)胞為對照，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及活力，分析細(xì)胞端粒酶活性，并檢測其成骨分化及增殖特性。結(jié)果 轉(zhuǎn)染SV40Tag基因后，SD大鼠牙囊細(xì)胞傳代至60代，生長依然旺盛，存在較強活力；牙囊細(xì)胞端粒酶活性顯著增強，與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.033）；牙囊細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因（堿性磷酸酶、骨鈣素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Runx2基因）、促有絲分裂相關(guān)基因（堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子）的電泳條帶與對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。結(jié)論 SV40Tag基因片段轉(zhuǎn)染SD大鼠牙囊細(xì)胞后具有無限傳代增殖和抗衰老的潛在能力，其細(xì)胞生物學(xué)特性相對穩(wěn)定，可為牙周組織工程提供較理想的種子細(xì)胞來源。

[關(guān)鍵詞] 牙囊細(xì)胞； 基因轉(zhuǎn)染； 端粒酶； 成骨分化； 增殖

[中圖分類號] Q 813 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.002 牙囊細(xì)胞（dental follicle cells，DFC）來源于形成牙周組織始基的牙囊[1]，系牙周組織工程研究中受到廣泛關(guān)注的種子細(xì)胞之一[2]。數(shù)量豐富并且細(xì)胞表型

和生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的種子細(xì)胞是牙周組織工程研究的前提[3]，但是牙囊細(xì)胞體外培養(yǎng)的數(shù)量較少，容易

失去自我更新能力發(fā)生老化。通過轉(zhuǎn)染外源性基因片段至目的細(xì)胞可以抑制細(xì)胞的衰亡，使有限的生命細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為具有長期傳代能力和穩(wěn)定表型的細(xì)胞。

猿腎病毒SV40大T抗原（simian virus 40 large tu-mor antigen，SV40Tag）是較常用和有效的外源性基

因之一[4]，目前國內(nèi)外已成功將其用于牙骨質(zhì)細(xì)胞

以及牙周膜成纖維細(xì)胞[5]的永生化構(gòu)建。本研究將

SV40Tag基因片段轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的SD大鼠牙囊細(xì)胞，對其傳代增殖能力和抗衰老能力、成骨分化及細(xì)胞增殖等生物學(xué)特征進(jìn)行觀察和檢測，為牙周組織工程研究的種子細(xì)胞來源提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1周齡SD大鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，含SV40Tag片段質(zhì)粒pSSR69、pAmpho、293細(xì)胞均由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院羅進(jìn)勇教授惠贈，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胰酶、Ⅰ型膠原酶、脂質(zhì)體2000、二甲基亞砜（dimethyl sul-foxide，DMSO）、聚凝胺（polybrene）、潮霉素（hygro-mycin）（Sigma公司，美國），端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telome-rase reverse transcriptase，TRT）抗體、山羊抗兔二抗、甘油醛三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Cell Signaling Technology公司，美國），焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）（Bio Basic公司，美國），Rever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo公司，日本），瓊脂糖（TaKaRa公司，日本）。

1.2 牙囊細(xì)胞體外培養(yǎng)及SV40Tag基因轉(zhuǎn)染

將SD大鼠引頸法處死后取出下頜第一磨牙牙胚，分離出牙囊組織立即置入DMEM培養(yǎng)基并剪成l～2 mm大小的組織塊。加入0.1%Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化1 h，0.25%胰蛋白酶消化5 min，離心棄上清液。加入DMEM培養(yǎng)基3 mL轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶。5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞生長形成單層后常規(guī)消化傳代并鑒定細(xì)胞來源。37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合至75%～80%時胰蛋白酶消化傳代。

利用293細(xì)胞包裝病毒構(gòu)建含SV40Tag的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒并轉(zhuǎn)染至SD大鼠牙囊細(xì)胞。方法：將293細(xì)胞按30%～40%密度鋪于T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁（8～12 h）后，設(shè)置轉(zhuǎn)染體系，將含有SV40Tag片段的pSSR69質(zhì)粒1～2 μg、pAmpho質(zhì)粒0.5～1.0 μg、脂質(zhì)體2000 15 μL、DMEM（無血

清、無雙抗）250 μL混合均勻，室溫放置15～20 min。將T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中293細(xì)胞用3 mL無血清、無雙抗的DMEM洗滌2遍，再加入無血清、無雙抗的DMEM 2.5 mL。將設(shè)置好的轉(zhuǎn)染體系加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，輕柔混合均勻。3～5 h后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基換成完全DMEM 4 mL，在繼續(xù)培養(yǎng)36、60、84、108 h后，分別收集細(xì)胞上清液（含有轉(zhuǎn)染體系），合計收集約16 mL，低速離心5 min去除細(xì)胞懸液，0.22～0.45 μm醋酸纖維膜濾器過濾，4 ℃保存?zhèn)溆?。將牙囊?xì)胞按20%～30%密度鋪于T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，等待細(xì)胞貼壁。在含有轉(zhuǎn)染體系的293細(xì)胞培養(yǎng)上清液中加入80～100 μL聚凝胺，吸取SD大鼠牙囊細(xì)胞培養(yǎng)基，換成含有轉(zhuǎn)染體系的細(xì)胞培養(yǎng)上清液4 mL，6～8 h后吸出上清液，再加入含有轉(zhuǎn)染體系的細(xì)胞培養(yǎng)上清液

4 mL，過夜培養(yǎng)，第2天換成完全DMEM 4 mL，培養(yǎng)4 h。2 μg·mL-1潮霉素篩選。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

以轉(zhuǎn)染SV40Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組，連續(xù)傳代至60代。在倒置相差顯微鏡下觀察2組的細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。

1.4 轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC端粒酶表達(dá)的檢測

采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western blot）檢測轉(zhuǎn)染

SV40Tag基因前后DFC端粒酶的表達(dá)。以轉(zhuǎn)染SV40-Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組。用預(yù)冷的PBS液清洗細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)于-20 ℃保存。配置工作液，酶標(biāo)儀測定562 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白定量。上樣50 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，去除氣泡，同時保持膠的濕潤。將其放入電泳槽，膠面向陰極，然后放入充滿緩沖液的緩沖槽，4 ℃電泳過夜后取出，棄膠。將膜放入染液中快速染色，然后放置于封閉液中，37 ℃下?lián)u晃4 h。5%的脫脂奶粉脫色搖床上洗膜15 min，封TRT一抗（1∶400）4 h，封二抗（1∶2 000）2 h，洗膜，顯影。應(yīng)用Image tool V

3.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，計算轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC的灰度值以及相應(yīng)的內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.5 轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相關(guān)基因

表達(dá)的檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)。以轉(zhuǎn)染SV40Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組，細(xì)胞消化后接種于96孔板，培養(yǎng)于加有礦化誘導(dǎo)液（地塞米松1×10-8 mol·L-1，β-甘油磷酸鈉50 mg·L-1，維生素C 10 mmol·L-1）的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其骨向分化，于第6天提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，在冰盒中配置20 μL合成體系，加入1 μL cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR法檢測2組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（alka-

line phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenesis protein，BMP）2、Runx2基因的表達(dá)。各引物序列見表1。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察電泳條帶并拍照記錄。

1.6 轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC促有絲分裂相關(guān)基

因表達(dá)的檢測

RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC促有絲分裂相關(guān)基因的表達(dá)。以轉(zhuǎn)染SV40Tag后的DFC為實驗組，正常DFC為對照組，檢測堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGF）的表達(dá)。引物序列見表2。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察電泳條帶并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長情況觀察

原代培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下見已貼壁的細(xì)胞呈梭形或多角形，胞體豐滿，胞突細(xì)長，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻，核圓居中。原代培養(yǎng)6～7 d后，可按1∶2進(jìn)行傳代。傳代9～10代后，細(xì)胞胞體變圓，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒，細(xì)胞增殖明顯減慢，提示細(xì)胞呈衰老征象。

轉(zhuǎn)染SV40Tag基因后，DFC細(xì)胞以多角形居多，呈束狀、柵欄狀或旋渦狀排列（圖1）。細(xì)胞傳代至60

代，生長依然旺盛，存在較強活力。對照組DFC傳代至9～10代后細(xì)胞活性降低，出現(xiàn)凋亡，難以繼續(xù)傳代。

Fig 1 Morphology of DFC infected with SV40Tag inverted mi-

croscope × 200

2.2 轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC端粒酶的表達(dá)

Western blot檢測表明，實驗組TRT灰度值明顯高于對照組（圖2），二者之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.033），表明轉(zhuǎn)染SV40Tag基因后DFC端粒酶活性明顯增強。

Fig 2 The TRT expression of DFC

2.3 轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC成骨分化相關(guān)基因的

表達(dá)

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，可見GAPDH擴(kuò)增片段大小為500 bp，實驗組和對照組的ALP、OC、BMP2、Runx2基因的電泳條帶均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05，圖3）。

Fig 3 Expression of ALP， OC， BMP2 and Runx2 by RT-PCR

2.4 轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后DFC促有絲分裂相關(guān)基因

的表達(dá)

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，可見GAPDH擴(kuò)增片段大小為

500 bp，實驗組和對照組的bFGF、IGF基因的電泳條帶均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05，圖4）。

Fig 4 Expression of bFGF and IGF by RT-PCR

3 討論

牙囊細(xì)胞作為牙周組織分化發(fā)育的前體細(xì)胞，體外培養(yǎng)難度較大，細(xì)胞量較少且傳代易衰亡[6]。普通

牙囊細(xì)胞經(jīng)過20～30群體倍增次數(shù)后即進(jìn)入危機期，細(xì)胞開始出現(xiàn)衰亡、退化[7]，難以獲得數(shù)量較多且

性狀一致的細(xì)胞。隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的出現(xiàn)，將外源性基因轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，可誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因突變，使有限的生命細(xì)胞逾越危機期，獲得極強的傳代增殖能力[8]。SV40Tag是目前較為常用且有效的體外永生化細(xì)胞的基因片段之一，可以通過與生長抑制因子pRB、p53和SEN6相互作用[9]，使細(xì)胞最終度過危機期避免細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到無限傳代增殖效應(yīng)且無致瘤性[10]。本研究將SV40Tag通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至SD大鼠DFC后，細(xì)胞傳代達(dá)60代，細(xì)胞生長依然旺盛且細(xì)胞活力不變。

端粒是線形染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，能防止染色體末端融合維持細(xì)胞染色體的穩(wěn)定[11]。普通

細(xì)胞中端粒的長度會隨著細(xì)胞分裂逐漸縮短，進(jìn)而衰老死亡，因此維持端粒的長度成為阻止細(xì)胞衰老的方法之一[12]。本研究對轉(zhuǎn)染SV40Tag前后的DFC細(xì)胞進(jìn)行TRT檢測，發(fā)現(xiàn)實驗組TRT灰度值明顯高于對照組，證明轉(zhuǎn)染SV40Tag后DFC的端粒酶被激活，端粒長度增加，提示轉(zhuǎn)染SV40Tag后的DFC具備抗衰老的特性。

轉(zhuǎn)染SV40Tag后的DFC獲得了極強的傳代和抗衰老能力，但其成骨分化和細(xì)胞增殖特性與正常牙囊細(xì)胞有無差異尚需要進(jìn)一步的研究。ALP是細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志[13]，OC是成骨活性細(xì)胞分化晚期的重要標(biāo)志[14]，Runx2基因是成骨細(xì)胞分化的

特異性轉(zhuǎn)錄因子[15]，BMP2通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)成骨

調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄直接及間接地促進(jìn)成骨分化[16]。本

實驗結(jié)果表明，實驗組與對照組細(xì)胞內(nèi)ALP、OC、BMP2、Runx2的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明SV40Tag轉(zhuǎn)染大鼠DFC后成骨早期和晚期分化能力以及成骨特異性因子的轉(zhuǎn)錄與正常牙囊細(xì)胞均無明顯差異，保持了相對一致性。IGF和bFGF[17]作為一種多肽生長因子，可促進(jìn)細(xì)胞在同一生長周期內(nèi)的增殖活性。本研究結(jié)果顯示，大鼠DFC轉(zhuǎn)染SV40Tag基因前后的IGF-1及bFGF表達(dá)水平均不具有統(tǒng)計學(xué)差異，表明轉(zhuǎn)染SV40Tag后大鼠DFC在細(xì)胞周期內(nèi)增殖活性與正常牙囊細(xì)胞無明顯差異，保持了功能狀態(tài)的穩(wěn)定。

本研究通過轉(zhuǎn)染SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊細(xì)胞，對其生物學(xué)特性觀察檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SV40Tag后的DFC獲得了無限傳代增殖和抗衰老的能力，染色體端粒長度得以維持。同時該細(xì)胞保持了與正常牙囊細(xì)胞相對一致的成骨分化特性和增殖活性，表明其生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有望成為牙周組織工程研究中較理想的種子細(xì)胞來源。

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（本文采編 王晴）