尹東　張佐　高素等

[摘要] 目的 檢測趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達及其在腫瘤細胞增殖和遷移中的作用。方法 采用逆轉錄聚合酶鏈式反應和Western blot法檢測20例口腔鱗狀細胞癌組織、頸部淋巴結組織、舌鱗狀細胞癌細胞株Tca8113、頰鱗狀細胞癌細胞株Bca885和10例正?？谇火つそM織中CXCR4的表達，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測CXCL12的表達，通過MTT法檢測細胞的增殖能力，通過趨化實驗觀察CXCR4特異性配體CXCL12對口腔鱗狀細胞癌細胞的趨化遷移作用。結果 1）在口腔鱗狀細胞癌組織、Tca8113細胞及Bca885細胞中，CXCR4 mRNA的相對表達量分別為2.31±1.13、1.89±1.20、1.67±1.10，CXCR4蛋白的相對表達量分別為1.36±0.15、1.85±0.34、1.97±0.23，正?？谇火つそM織在mRNA及蛋白質水平均未檢測到CXCR4表達?？谇话┗颊哳i部淋巴結組織中，CXCL12 mRNA表達量的平均值為1.14±0.87，而口腔鱗狀細胞癌組織和正常口腔黏膜組織未檢測出CXCL12的表達。2）口腔鱗狀細胞癌細胞在CXCL12作用下增殖反應明顯增強，CXCR4抗體可明顯抑制腫瘤細胞的增殖。3）趨化實驗顯示CXCL12可誘導口腔鱗狀細胞癌細胞發(fā)生明顯遷移，在30～100 ng·mL-1的范圍內，誘導口腔鱗狀細胞癌細胞遷移的作用呈明顯量效關系。結論 CXCR4/CXCL12受體配體系統(tǒng)可介導口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移，在癌細胞向頸部淋巴結轉移中發(fā)揮著重要作用。

[關鍵詞] 口腔鱗狀細胞癌； 趨化因子受體； 增殖； 遷移

[中圖分類號] R 730.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.003 口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是發(fā)生于口腔黏膜的鱗狀細胞癌，具有局部侵襲力強且易向頸部淋巴結轉移的特點，而頸部淋巴結轉移對患者的預后影響很大。趨化因子是一種能夠結合到靶細胞上的特異性G蛋白偶聯(lián)受體的化學誘導因子，參與調節(jié)生理性和病理性白細胞遷移。研究[1]發(fā)現(xiàn)，趨化因子及其受體與腫瘤侵襲、轉移密切相關，尤其是趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12相互作用所構成的反應軸在多種腫瘤的發(fā)生、增殖、分化和器官特異性轉移中發(fā)揮著重要作用[2-4]。已有研究[5-7]表明，不同的腫瘤細胞可表達趨化因子受體CXCR4，而其配體CXCL12則高表達于癌細胞轉移相關部位。它們不僅與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關，而且有可能成為腫瘤治療的一個新靶點。本課題組在以前的實驗[8]中已經(jīng)證實，趨化因子受體

CXCR4在口腔鱗狀細胞癌中有表達，并與口腔鱗狀細胞癌淋巴結轉移有關。為了進一步了解趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12在口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移中的作用，本研究檢測了口腔鱗狀細胞癌組織、舌癌細胞株Tca8113、頰癌細胞株Bca885中CXCR4以及口腔鱗狀細胞癌組織及其頸部淋巴結組織中CXCL12的表達，并對其增殖、趨化和遷移活性進行相應分析，以期為CXCR4和CXCL12誘導口腔鱗狀細胞癌細胞定向遷移提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象和標本來源

1.1.1 細胞株和主要試劑 口腔鱗狀細胞癌細胞株Tca8113和Bca885均購自四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室，用含10%新生小牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。二甲基亞砜

（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT液（Sigma公司，美國）；鳥類成髓細胞白血病病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆轉錄酶、Taq NDA多聚酶（Takara公司，日本）；CXCL12（Cytolab公司，美國）、兔抗人CXCR4抗體（R&D;公司，美國）。趨化小室與8.0 μm孔徑多聚碳酸酯膜（Neutroprobe公司，美國）。

1.1.2 臨床標本 選取2010年7月至2011年7月在寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院住院手術治療的20例口腔鱗狀細胞癌患者，采集標本進行研究。20例患者中，男性13例，女性7例；年齡19～81歲，平均60歲；按國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，

UICC）（2002年）標準進行分期，Ⅱc期4例，Ⅲa期7例，Ⅲb期4例，Ⅲc期5例。20例患者中，分別取其頸部淋巴結組織各1枚（共20枚），其中14枚為轉移淋巴結組織；另取其中10例正常口腔黏膜組織同時進行研究。所有標本均經(jīng)術后病理學檢查和驗證。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 在手術中無菌收集口腔癌患者的口腔鱗狀細胞癌組織、頸部淋巴結組織和正?？谇火つそM織，置液氮中保存。

1.2.2 CXCR4和CXCL12 mRNA表達水平的測定 將口腔鱗狀細胞癌組織、頸部淋巴結組織和正?？谇火つそM織勻漿，與Tca8113和Bca885細胞一起，均用TRIzol試劑一步法提取組織和細胞中的總RNA。用AMV逆轉錄酶進行逆轉錄聚合酶鏈式反應（polyme-

rase chain reaction，PCR）擴增CXCR4和CXCL12，同時擴增β-actin作為內參照。CXCR4引物序列為：正義鏈5-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3，反義鏈5-GCGCTFCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3；CXCL12引物序列為：正義鏈5-CCGCGCTCTGCC-TCAGCGACGGGAAG-3，反義鏈5-CTTGTTTAA-AGCTTTCTCCAGGTACT-3。CXCR4和CXCL12 PCR產(chǎn)物的擴增長度分別為260 bp和227 bp。以上引物均由上海亞法生物工程公司合成。PCR反應條件：94 ℃變性30 s，56 ℃退火3 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min后結束反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)15%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照，利用投射儀圖像分析系統(tǒng)掃描，確定條帶的光密度值。整個逆轉錄PCR過程獨立重復3次，以3次實驗所得光密度值的平均數(shù)表示mRNA相對表達量。

1.2.3 Western blot分析 將同樣大小口腔鱗狀細胞癌組織及正常口腔黏膜組織勻漿，以細胞裂解液將組織勻漿及細胞裂解，參照文獻[9]的方法提取蛋白質。取80 μg蛋白質樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），轉膜，室溫封閉

1 h后，加入含0.05% Tween 20的TBS緩沖液稀釋的CXCR4兔抗人單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBS緩沖液漂洗3次后，加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000），37 ℃溫育1 h，增強化學發(fā)光系統(tǒng)顯色。利用投射儀圖像分析系統(tǒng)掃描確定X線片上雜交條帶的光密度值。實驗獨立重復3次，以3次實驗所得光密度值的平均數(shù)表示蛋白質的含量。

1.2.4 MTT法測定細胞增殖 收集Tca8113細胞，加入96孔板（每100 μL含1×104個細胞）。實驗設置4組：1組為對照組，Tca8113細胞加RPMI1640培養(yǎng)液；2組為CXCL12刺激組，Tca8113細胞加RPMI1640培

養(yǎng)液、100 ng·mL-1 CXCL12；3組為CXCL12中和組，Tca8113細胞用CXCR4中和抗體（50 μg·mL-1）作用

30 min后加RPMI1640培養(yǎng)液、100 ng·mL-1 CXCL12；4組為CXCR4抑制組，加入RPMI1640培養(yǎng)液、

15 μg·mL-1 CXCR4。4組分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，使結晶

物充分溶解后，以490 nm波長處各孔的光密度值表示細胞的增殖情況。

1.2.5 趨化實驗 參照文獻[10]的方法用48孔趨化小

室檢測人重組CXCL12對CXCR4陽性口腔癌細胞的趨化作用。下室各加入不同質量濃度（10～150 ng·mL-1）

的重組人CXCL12，同時以無趨化因子的培養(yǎng)基作陰性對照；每組均設3個復孔。上室加入口腔鱗狀細胞癌細胞懸液，上下室之間鋪多聚碳酸酯膜。將趨化小室置于37 ℃含5%CO2孵箱中孵育4 h，然后以PBS棉簽拭去膜背面的細胞，70%甲醇固定，蘇木精染色，置于光鏡下計數(shù)至少5個視野（放大200倍）的細胞數(shù)。計算趨化指數(shù)，即遷移到含有不同質量濃度趨化因子液體膜側的細胞數(shù)與遷移到陰性對照液膜側的細胞數(shù)的比值，以趨化指數(shù)的大小表示趨化活性的高低。實驗獨立重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，組間方差齊時采用t檢驗，方差不齊時采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 CXCR4和CXCL12 mRNA水平的表達

口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞以及Bca885細胞CXCR4的mRNA相對表達量分別為1.89±1.20和1.67±1.10；20例口腔鱗狀細胞癌組織表達CXCR4 mRNA的相對表達量為2.31±1.13，與臨床分期無明顯相關性（r=0.1，P>0.5）；10例正常口腔黏膜組織未檢測

出CXCR4 mRNA的表達?？谇击[狀細胞癌患者頸部淋巴結組織中CXCL12 mRNA表達率為75%（15/20），其相對表達量為1.14±0.87，而口腔鱗狀細胞癌組織、口腔鱗狀細胞癌細胞株和正?？谇火つそM織未檢測出CXCL12 mRNA的表達。CXCR4和CXCL12 mRNA的電泳結果見圖1。

1：DNA Marker；2：正?？谇火つそM織；3：口腔鱗狀細胞癌組織；4：Tca8113細胞；5：Bca885細胞；6：淋巴結組織。

Fig 1 Expression of CXCR4和CXCL12 mRNA in different cell

lines and tissues

2.2 CXCR4蛋白的表達

20例口腔鱗狀細胞癌組織均可檢測到CXCR4蛋白的表達，相對表達量為1.36±0.15；Tca8113和Bca885細胞的CXCR4蛋白相對表達量分別為1.85±0.34和1.97±0.23；10例正?？谇火つそM織未檢測出CXCR4蛋白的表達。CXCR4蛋白的Western blot分析見圖2。

Fig 2 Expression of CXCR4 protein in different cell lines and

tissues

2.3 CXCR4/CXCL12反應軸在Tca8113細胞增殖中的

作用

MTT法測量細胞增殖的結果見表1。作用24、48 h時CXCL12刺激組Tca8113細胞的增殖無明顯變化，作用72 h后細胞的增殖反應明顯增強，CXCL12刺激組的細胞數(shù)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<

0.01）。作用72 h后，CXCL12中和組的細胞數(shù)明顯低于CXCL12刺激組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），可見預先孵育CXCR4抗體可以對抗CXCL12的促增殖作用。CXCR4抑制組在24、48、72 h時的細胞數(shù)均明顯低于對照組（P<0.01），可見CXCR4抗體本身對Tca8113細胞的增殖也有明顯的抑制作用。

2.4 重組CXCL12對Tca8113細胞趨化和遷移的影響

當趨化小室的下室未加入CXCL12趨化因子時，Tca8113細胞遷移的數(shù)目分別為10個左右，當下室加入10～150 ng·mL-1的CXCL12后，遷移的細胞數(shù)明顯增加，分別為12.41±4.20、18.64±3.25、29.57±5.24、33.63±5.34、29.35±5.27，其趨化指數(shù)見圖3。在30～100 ng·mL-1范圍內，CXCL12誘導Tca8113細胞的趨化遷移呈劑量依賴關系，達到最大遷移效果的CXCL12質量濃度為100 ng·mL-1。

Fig 3 Chemotactic indices of oral squamous cell carcinoma cells

in response to different concentrations of CXCL12

3 討論

腫瘤的侵襲、轉移是一個具有高度組織性和器官選擇性的多因素、多步驟的過程。雖然已證明很多因素參與了腫瘤的侵襲和轉移，但不同組織來源的腫瘤細胞遷徙到特定部位的分子機制還不清楚。趨化因子能夠調控細胞的遷移，特別是在免疫和炎癥反應中誘導白細胞遷移。CXCL12是CXC亞家族成員，可與其唯一的跨膜受體CXCR4相互作用。有研究[11]顯示，淋巴管內皮細胞通過分泌趨化因子吸引

腫瘤細胞，進而主動性促進腫瘤細胞的淋巴轉移，這一過程類似于免疫刺激過程中樹突狀細胞的正常遷移。在腫瘤細胞定向遷移的過程中，趨化因子通過與腫瘤細胞表面相應的受體相互作用，誘導腫瘤細胞骨架重排，促使腫瘤細胞緊密黏附于淋巴管內皮細胞，最終實現(xiàn)定向性遷移[11]。還有研究[12-14]表明，不同的腫瘤細胞中可表達趨化因子受體CXCR4，而其唯一的配體CXCL12在淋巴結、骨髓、肺等轉移的好發(fā)部位中表達水平極高，CXCR4與CXCL12相互作用與許多腫瘤的發(fā)生、生長和轉移密切相關。通過逆轉錄PCR，本研究檢測到在口腔鱗狀細胞癌組織、Tca8113及Bca885細胞中有CXCR4 mRNA及蛋白的相對表達，而在正?？谇火つそM織中則無表達；同時，在口腔鱗狀細胞癌患者頸部淋巴結組織中還檢測到了CXCL12 mRNA的高表達，而在口腔鱗狀細胞癌組織、口腔鱗狀細胞癌細胞株和正?？谇火つそM織中未見CXCL12 mRNA表達，這說明CXCR4/CXCL12的相互作用可能在口腔鱗狀細胞癌的侵襲和頸部淋巴結轉移中起著重要作用。

CXCR4/CXCL12與腫瘤細胞的增殖也有重要關系。本研究通過MTT法檢測細胞增殖，發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌細胞在CXCL12作用24、48 h后增殖反應不明顯，72 h后才明顯增強。這與Kang等[15]報道的CXCL12在短期內刺激細胞增殖不明顯而后期效果顯著的結論相一致。CXCL12的空間結構受微環(huán)境，如pH值、磷酸鹽、硫酸鹽、肝素濃度等，特別是pH值的調節(jié)；CXCL12在酸性條件下呈可溶性單體，中性或偏堿性時則呈結晶二聚體[16]。隨著CXCL12作用時間的延長，腫瘤細胞生長使微環(huán)境pH值下降，CXCL12活性增加，導致CXCL12在短期內刺激細胞增殖不明顯而后期的刺激效果顯著。本研究還發(fā)現(xiàn)，預先用CXCR4抗體結合細胞膜上的CXCR4受體可不同程度地中和CXCL12，抑制CXCL12對鱗狀細胞癌細胞的促增殖作用；同時CXCR4抗體本身對鱗狀細胞癌細胞的增殖也有明顯的抑制作用。Bertolini等[17]報道：用CXCR4

單克隆抗體中和非霍奇金淋巴瘤細胞的CXCR4蛋白，可減弱瘤細胞的增殖并促進瘤細胞凋亡，這表明細胞膜表面CXCR4受體起到的不僅僅是與特異性配體CXCL12結合的作用，還可以激活一系列信號通路，引起腫瘤細胞的一系列變化[18]。本研究結果也間接

表明CXCR4在腫瘤細胞增殖中的作用不容忽視。

癌細胞的定向遷移和侵襲是腫瘤轉移的關鍵步驟。Müller等[2]發(fā)現(xiàn)：人乳腺癌細胞表達CXCR4受體，而正常乳腺上皮細胞不表達；其配體CXCL12在淋巴結、骨髓、肺等好發(fā)的轉移部位的表達水平極高。該研究[2]結果表明：乳腺癌細胞表達CXCR4，能與

CXCL12結合導致肌動蛋白聚合及偽足形成，隨后出現(xiàn)化學趨向性和侵潤反應；而通過特異性抗體阻斷CXCR4能抑制乳腺癌細胞的定向遷移和侵襲。本實驗發(fā)現(xiàn)，CXCL12在30～100 ng·mL-1范圍內能夠誘導口腔鱗狀細胞癌細胞發(fā)生遷移運動，且該作用呈明顯的量效關系。這提示口腔鱗狀細胞癌細胞可通過表達有功能活性的趨化因子受體CXCR4，與CXCL12相互作用后可誘發(fā)細胞與肌動蛋白聚合相關的偽足形成、定向性遷移和侵襲，實現(xiàn)腫瘤細胞向淋巴結的轉移。

綜上所述，CXCR4/CXCL12受體配體系統(tǒng)可介導口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移，可能與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結轉移有關，干擾CXCR4/CXCL12的相互作用有可能成為治療口腔鱗狀細胞癌的一個有意義的靶點和策略。

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（本文采編 陳謙明）