周秋枝，黃 蕾，沈丹華，張 濱，粟登權(quán)，曾 丹，鄢又玉

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

火棘(Pyracantha fortuneana)屬于薔薇科蘋(píng)果亞科(Maloideane)，是一種藥食兩用多用途常綠野生灌木，在我國(guó)有7個(gè)種屬，主要分布于東南、西南和西北部，分布廣泛，資源豐富，其乙醇提取物含豐富的原花青素，具有清除自由基［1］、抗氧化［2］、抗病毒［3］、抗細(xì)菌［4-5］和抑制腫瘤［6］等多種功效，廣泛應(yīng)用于食品、藥品及化妝品等領(lǐng)域，市場(chǎng)前景廣闊。原花青素是一類多酚類混合物，化學(xué)成分復(fù)雜，其含量測(cè)定目前國(guó)際上并無(wú)統(tǒng)一的方法。鐵鹽催化比色法［7］在國(guó)外最早是由 Swain和 Hillis［8］提出，其反應(yīng)特征性顯著，操作簡(jiǎn)便，但重現(xiàn)性較差;正丁醇—鹽酸法［9］選擇性高，但受多酚結(jié)構(gòu)的影響較大，與兒茶素單體不反應(yīng);HPLC法［10］測(cè)得的結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但其所需單體的獲得操作復(fù)雜，不易得到;HPLC-MS法［11］只能測(cè)得原花青素的相對(duì)含量，不能作為定量分析的方法;香草醛-鹽酸法［12］對(duì)縮合單寧的選擇性雖然不是很好，但其對(duì)原花青素的反應(yīng)靈敏度高，重現(xiàn)性好。鮑俊竹［13］、姚開(kāi)等［14-15］采用香草醛-鹽酸法、香草醛-硫酸法和正丁醇-鹽酸法3種方法測(cè)定葡萄籽提取物中原花青素含量，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較，表明香草醛-鹽酸法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，優(yōu)于其它方法。因此香草醛鹽酸法較適用于低濃度原花青素樣品測(cè)定。目前香草醛法主要用于葡萄籽、薔薇、蓮子皮等原花青素的含量測(cè)定，其操作方式較多，差別較大［16-22］。國(guó)內(nèi)外關(guān)于火棘中原花青素的研究甚少，對(duì)火棘中原花青素含量測(cè)定方法的研究更未見(jiàn)報(bào)道，因此有必要優(yōu)化建立專屬火棘中原花青素含量測(cè)定的方法。本課題在前人研究的基礎(chǔ)上［16-22］，選用香草醛-鹽酸法對(duì)火棘果中原花青素的含量進(jìn)行測(cè)定，考察了標(biāo)準(zhǔn)物、光照條件、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鹽酸濃度、香草醛濃度等因素對(duì)原花青素與香草醛顯色反應(yīng)的影響，最終確定了適合火棘提取液中原花青素含量測(cè)定的方法，該方法簡(jiǎn)便可行，具有良好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性，可為火棘資源的進(jìn)一步深度開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火棘提取物 實(shí)驗(yàn)室自制;實(shí)驗(yàn)用水 均為去離子水;無(wú)水乙醇、甲醇、鹽酸、香草醛 均為分析純;(+)-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司。

萬(wàn)分之一電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;隔膜真空泵GM-1.0A 天津市沸騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;集熱式磁力加熱攪拌器DF-101B 金壇市醫(yī)療儀器廠;5424R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5424R)德國(guó)eppendorf;UV-5800PC掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 火棘提取物制備 干燥去籽后的火棘果皮肉粉粉碎，過(guò)20目篩→體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇浸提兩次→抽濾→離心→上清液。取5mL上清液至25mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度一定的火棘提取物溶液，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別吸取質(zhì)量濃度1.0mg/mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1mL，至10mL試管中，加入4g/100mL香草醛甲醇溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用，以下操作相同)6mL，濃鹽酸3mL，搖勻，水浴30℃條件下避光反應(yīng)30min后，空白對(duì)照以甲醇代替，其它步驟相同。在波長(zhǎng)400～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取1.0mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液各 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mL至10mL試管中，用甲醇稀釋至1mL，配制成質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mg/mL的濃度梯度系列，搖勻，再向其中加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液和3mL濃鹽酸，混勻，在30℃水浴避光反應(yīng)30min后，用甲醇代替標(biāo)準(zhǔn)品作空白對(duì)照，于λ500nm處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度對(duì)吸光度進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.4 火棘提取物與香草醛/鹽酸反應(yīng)的影響因素

1.2.4.1 光照及反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響 取一定濃度的火棘提取物溶液1mL，至10mL試管中，加入4g/100mL香草醛甲醇溶液6mL，濃鹽酸3mL，搖勻，水浴30℃條件下反應(yīng)30min后，以甲醇為空白對(duì)照，于λ500nm處測(cè)定吸光度。考察避光與不避光條件下，溶液放置 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min時(shí)火棘提取物與香草醛反應(yīng)后溶液吸光度的變化。

1.2.4.2 溫度對(duì)吸光度的影響 取一定濃度的火棘提取物溶液1mL，至10mL試管中，參照1.2.2反應(yīng)體系，以甲醇為空白對(duì)照，其它步驟相同?？疾鞙囟雀鳛?0、30、40、50℃時(shí)對(duì)火棘提取物與香草醛反應(yīng)的吸光度的影響。

1.2.4.3 鹽酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的影響 取一定濃度的火棘提取物溶液1mL，至10mL試管中，參照1.2.2反應(yīng)體系，以甲醇為空白對(duì)照，其它步驟相同?？疾禧}酸體積分?jǐn)?shù)各為 20%、40%、60%、80%、100%時(shí)火棘提取物與香草醛反應(yīng)的吸光度的變化情況。

1.2.4.4 香草醛質(zhì)量濃度對(duì)吸光度的影響 取一定濃度的火棘提取物溶液1mL，至10mL試管中，參照1.2.2反應(yīng)體系，以甲醇為空白對(duì)照，其它步驟相同?？疾煜悴萑┵|(zhì)量濃度各為 0.5、1、2、3、4、5、6g/100mL時(shí)對(duì)火棘提取物與香草醛反應(yīng)的吸光度的影響。

1.2.5 測(cè)定方法評(píng)價(jià)

1.2.5.1 火棘提取物溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系的建立 分別制備質(zhì)量濃度為 2.4、3、4、6、8、10、12、15mg/mL 火棘提取物溶液，各取0.1mL至10mL試管中，加入甲醇稀釋至1mL，然后分別加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液和3mL濃鹽酸，混勻，在30℃水浴中不避光反應(yīng)10min后，用甲醇代替標(biāo)準(zhǔn)品作空白對(duì)照，在A500處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度對(duì)吸光度進(jìn)行回歸分析，得樣品曲線方程，以確定火棘果提取物溶液的濃度線性范圍。

1.2.5.2 方法的重復(fù)性考察 取質(zhì)量濃度為2.4mg/mL和15mg/mL的火棘提取物溶液各1mL，至10mL試管中，分別加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL濃鹽酸，按照最佳實(shí)驗(yàn)條件顯色反應(yīng)后測(cè)定A500，共測(cè)定5次。此測(cè)定在相同條件下由同一分析人員獨(dú)立完成。

1.2.5.3 方法的穩(wěn)定性考察 取質(zhì)量濃度為2.4mg/mL和15mg/mL的火棘提取物溶液各1mL，至10mL試管中，分別加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL濃鹽酸，按照最佳實(shí)驗(yàn)條件，每隔10min在A500下測(cè)定一次反應(yīng)液的吸光度，連續(xù)測(cè)定5次。測(cè)定結(jié)果之間的精密度稱為穩(wěn)定性。

1.2.5.4 方法的重現(xiàn)性考察 取質(zhì)量濃度為2.4mg/mL和15mg/mL的火棘提取物溶液各1mL，至10mL試管中，分別加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL濃鹽酸，按照最佳實(shí)驗(yàn)條件顯色后測(cè)定A500，共測(cè)定5次。此測(cè)定在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同分析人員完成，測(cè)定結(jié)果之間的精密度稱為重現(xiàn)性。

1.2.5.5 測(cè)定方法的回收率實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為6mg/mL的火棘提取物溶液0.9mL，至10mL試管中，向其中加入0.1mL甲醇，搖勻，再加入6mL 4g/100mL香草醛甲醇溶液及3mL濃鹽酸，按照最佳實(shí)驗(yàn)條件顯色后測(cè)定A500，確定此火棘提取物溶液中原花青素的含量。再取質(zhì)量濃度為6mg/mL的火棘提取物溶液0.9mL，至10mL比色管中，加入0.25mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1mL，按照同樣方法測(cè)定混合后溶液中的原花青素含量，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算該法的回收率。

回收率(%)=(原花青素測(cè)得量-原花青素原有量)/加入原花青素的量×100

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及最大吸收波長(zhǎng)的確定

按照1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，以兒茶素及原花青素為標(biāo)準(zhǔn)品顯色反應(yīng)后溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為500nm，但是在同樣條件下以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，顯色反應(yīng)后溶液的吸光度值高很多，因此靈敏度相對(duì)以原花青素為標(biāo)樣時(shí)更高一些，故在測(cè)定低濃度原花青素樣品時(shí)，選擇兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品較為合適，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為500nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可知兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度Y與兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X之間的回歸方程為:Y=2.0936X+0.0461，R2=0.9963，吸光度在質(zhì)量濃度0.05～0.40mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，其中X為兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)，Y為吸光度。其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 兒茶素及原花青素標(biāo)樣紫外掃描圖Fig.1 UV wavelength scanning diagram of catechin and procyanidins standard substance

圖2 香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of proanthocyanidin by vanillin-HCl assay

2.3 火棘提取物與香草醛鹽酸反應(yīng)的影響因素

2.3.1 光照及反應(yīng)時(shí)間的影響 按照1.2.4.1方案設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，在避光與不避光條件下火棘提取物與香草醛-鹽酸反應(yīng)的吸光度并沒(méi)有顯著的差別，兩種情況下隨著時(shí)間的逐步延長(zhǎng)，吸光度值逐漸減小，考慮實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)用性，故可在不避光、顯色反應(yīng)10min時(shí)測(cè)定火棘提取物與香草醛反應(yīng)的吸光度。

圖3 光照及反應(yīng)時(shí)間對(duì)原花青素測(cè)定結(jié)果的影響Fig.3 Effect of light and reaction time on the determination results of proanthocyanidins

2.3.2 溫度的影響 在2.3.1確定的條件下，考察溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。分析可知，火棘提取物與香草醛顯色反應(yīng)后溶液的吸光度隨著溫度的改變發(fā)生了明顯的變化，最初吸光度隨溫度升高先逐步增大，在30℃時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著溫度進(jìn)一步升高吸光度值快速減小，由此可以確定最適宜的顯色溫度為30℃。

圖4 溫度對(duì)原花青素測(cè)定結(jié)果的影響Fig.4 Effect of temperature on the determination results of proanthocyanidins

2.3.3 鹽酸體積分?jǐn)?shù) 在確定的條件下，考察鹽酸加入量對(duì)顯色反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。分析可知，火棘提取物與香草醛顯色反應(yīng)后溶液的吸光度隨著鹽酸體積分?jǐn)?shù)的增加先快速增加，后增加趨勢(shì)漸緩，在體積分?jǐn)?shù)100%時(shí)吸光度達(dá)到最大。因此在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受影響、空白對(duì)照顏色不發(fā)生變化的情況下，選擇鹽酸體積分?jǐn)?shù)為100%較合適，即直接以濃鹽酸參與顯色反應(yīng)。

圖5 鹽酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素測(cè)定結(jié)果的影響Fig.5 Effect of HCl on the determination results of proanthocyanidins

2.3.4 香草醛質(zhì)量濃度 在確定的條件下，考察香草醛質(zhì)量濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。分析可知，隨著香草醛質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)的吸光度逐漸增大。當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)4g/100mL時(shí)，雖然吸光度依然緩慢增大，但增加幅度極緩，并且，當(dāng)質(zhì)量濃度高于4g/100mL時(shí)，空白溶液變?yōu)辄S綠色，這可能是因?yàn)橄悴萑舛冗^(guò)高發(fā)生自身縮合引起，所以選用香草醛質(zhì)量濃度為4g/100mL比較合適。

2.4 測(cè)定方法評(píng)價(jià)

2.4.1 火棘提取物溶液曲線關(guān)系考察 按照1.2.5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可知，火棘提取物溶液的吸光度Y與溶液質(zhì)量濃度X之間的回歸方程為:Y=0.0496X+0.0892，R2=0.9965，吸光度在質(zhì)量濃度 2.4～15mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，這為之后方法評(píng)價(jià)提取物濃度范圍選擇提供了理論依據(jù)，其中X為濃度(mg/mL)，Y為吸光度。火棘原花青素提取物溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖7。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 1 Repeatability tests of the determination results

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 2 Stability tests of the determination results

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 3 Reproducibility tests of the determination results

表4 原花青素回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Recovery tests of proanthocyanidins

圖6 香草醛質(zhì)量濃度對(duì)原花青素測(cè)定結(jié)果的影響Fig.6 Effect of vanillin concentration on the determination results of proanthocyanidins

圖7 火棘原花青素提取物溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curves of proanthocyanidins in pyracantha fortuneana extract solution

2.4.2 方法的重復(fù)性考察 按照1.2.5.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，此測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差各為0.0023和0.0098，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差各為1.234%和1.156%，呈現(xiàn)出良好的重復(fù)性。

2.4.3 方法的穩(wěn)定性考察 按照1.2.5.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，此測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差各為0.0052和0.0321，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差各為3.19%和4.02%，因此在溶液顯色反應(yīng)后50min以內(nèi)，此測(cè)定方法有良好的穩(wěn)定性。

2.4.4 方法的重現(xiàn)性考察 按照1.2.5.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，此測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差各為0.0008和0.0013，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差各為0.55%和0.16%，因此測(cè)定方法具有極好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.4.5 方法的加標(biāo)回收率測(cè)定 按照1.2.5.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，求出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，此實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定原花青素的回收率為101.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.98%。說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)具有較高的回收率，精密度良好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用香草醛-鹽酸法測(cè)定了火棘提取物中原花青素的含量，分別考察了標(biāo)準(zhǔn)物、光照條件、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鹽酸濃度、香草醛濃度等因素對(duì)原花青素與香草醛顯色反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，香草醛-鹽酸法測(cè)定火棘提取物中原花青素含量的適宜條件為:1mL提取液，6mL 4%香草醛甲醇溶液以及3mL濃鹽酸，混勻后不避光條件下30℃水浴保溫10min后，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，波長(zhǎng)500nm處測(cè)定吸光度值。該測(cè)定方法具有良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，回收率較高。

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