（中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110001）

5-羥色胺（5-hydroxytrptamine，5-HT）是重要的單胺類中樞神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種中樞神經(jīng)活動。研究證明5-HT的功能紊亂與多種精神疾病相關(guān)[1-4]。色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）是 5-HT 合成的第一個也是唯一的限速酶，因此，TPH基因表達(dá)正常與否直接影響5-HT的合成量，進(jìn)而影響其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能[5]。過去一直認(rèn)為TPH來源于單基因（現(xiàn)在指 TPH1），直到 2003 年，Walther等[6]發(fā)現(xiàn)第二種TPH亞型——TPH2。人類TPH2基因位于12q21.1，全長93.5kb，包含11個外顯子。TPH2主要在腦干表達(dá)，負(fù)責(zé)中樞5-HT的合成，因而TPH2基因也成為與5-HT功能紊亂相關(guān)的精神疾病遺傳學(xué)研究中的一個重要的候選基因。

本研究擬通過直接測序的方法調(diào)查TPH2基因5′、3′端遺傳多態(tài)性在中國北方漢族群體的分布情況，為相關(guān)疾病分析提供遺傳學(xué)參數(shù)，同時探討其法醫(yī)學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

244例中國北方漢族無血緣關(guān)系健康個體肘靜脈血液樣品，由中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。枸櫞酸鈉抗凝、酚-氯仿有機(jī)溶劑提取法提取白細(xì)胞的基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增與測序

設(shè)計并合成兩對特異性引物，分別擴(kuò)增TPH2基因 5′端 905bp和 3′端 1104bp的兩個目的片段。5′端上游引物序列為 5′-TGCATAGAGGCATCACAGGA-3′，下游引物序列為 5′-AGCAGGGGGTACTAGAGGG-3′；3′端上游引物序列為 5′-ATTACCCGTCCCTTCTCA-3′，下游引物序列為 5′-CAAGCACTGGGACGAAT-3′。 擴(kuò)增體系20 μL，其中包括LA-Taq DNA聚合酶（大連寶生物工程有限公司）0.2μL（1U）、10×緩沖液 2μL、dNTP 1.6 μL、DNA 模板 2 μL（5～10 ng）、上下游引物各 1.6μL（0.5pmol/μL）、去離子水 11μL。PCR 反應(yīng)在T-Gradient梯度PCR儀（德國Biometra公司）上進(jìn)行。5′端目的片段熱循環(huán)條件為94℃ 1min；94℃ 1min，67℃ 40s，72℃ 1min，33 個循環(huán)；72℃ 2min。3′端目的片段熱循環(huán)條件為94℃ 1 min；94℃ 1 min，64℃40s，72℃ 1min，33 個循環(huán)；72℃ 2min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后應(yīng)用原PCR擴(kuò)增引物在3130遺傳分析儀（美國AB公司）上進(jìn)行雙向測序分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)測序結(jié)果運(yùn)用直接計數(shù)法計算基因型頻率和等位基因頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。按 Odelberg 法計算雜合度（H）、個體識別率（DP）、非父排除率（PE）和多態(tài)信息含量（PIC）。按 Nei和ChaKraborty法計算雜合度。應(yīng)用Halpoview v4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 TPH2基因5′和3′端SNP位點檢測結(jié)果

244例中國北方漢族個體測序結(jié)果顯示除已報道的 rs4570625（－703G/T）、rs11178997（－473T/A）、rs11178998（90A/G）、rs41317118（92999G/A）、rs17110747（93329G/A）和 rs41317114（93724G/C）6個SNP位點外，在92922位點檢測到1例C/T變異（表1，圖1），由于其等位基因頻率小于1%，因此考慮為突變。另外，在92999G/A位點未檢出AA基因型，說明該基因型在中國北方漢族群體比較少見。

表1 TPH2基因5′、3′端變異位點檢測結(jié)果

圖1 TPH2基因92922C/T位點雜合子序列分析圖

2.2 TPH2基因5′、3′端SNP位點多態(tài)性調(diào)查結(jié)果

TPH2基因6個SNP位點基因型頻率、等位基因頻率見表2，經(jīng)χ2檢驗，6個SNP位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）。

表2 中國北方漢族群體TPH2基因6個SNP位點基因型頻率、等位基因頻率 （%）

2.3 TPH2基因5′、3′端SNP位點連鎖不平衡分析

應(yīng)用Halpoview v4.2軟件對TPH2基因6個SNP位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示，5′端3個SNP位點之間和3′端3個SNP位點之間存在緊密連鎖（圖2）。因此，確定兩個單倍型分區(qū)分別為Block1和Block2。相應(yīng)的單倍型頻率和基因型頻率見表3。

2.4 TPH2基因5′、3′端SNP位點的群體遺傳學(xué)參數(shù)

根據(jù)TPH2基因5′、3′端SNP位點在中國北方漢族群體的遺傳多態(tài)性分布情況，計算各位點的群體遺傳學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4。其中－703G/T、93329G/A和5′、3′端SNP位點分別構(gòu)成的單倍型均具有較高的個體識別率和非父排除率。

圖2 TPH2基因5′、3′端SNP位點連鎖不平衡示意圖

表3 中國北方漢族群體TPH2基因5′、3′端SNP位點分別構(gòu)成的單倍型和基因型頻率

表4 TPH2基因5′、3′端SNP位點及單倍型的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=244）

3 討 論

3.1 TPH2基因 5′、3′端 SNP位點在中國北方漢族群體的分布情況

SNP是繼DNA指紋圖、微衛(wèi)星之后的第三代遺傳標(biāo)記，作為全新一代遺傳標(biāo)記具有分布廣、多態(tài)信息含量豐富、突變率低、易于判型、適于快速高流量檢測等特點，目前成為醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等研究的熱點。

本研究采用直接測序的方法調(diào)查TPH2基因5′、3′端SNP位點在中國北方漢族群體的分布情況。根據(jù)測序結(jié)果，共檢測到7個變異位點，其中6個位點具有遺傳多態(tài)性，分別為 rs4570625（－703G/T）、rs11178997（－473T/A）、rs11178998（90A/G）、rs41317118（92999 G/A）、rs17110747（93329G/A）和 rs41317114（93724 G/C）。 rs11178997、rs41317114 為轉(zhuǎn)換，rs4570625、rs11178998、rs41317118、rs17110747 為顛換。上述 6 個SNP位點均位于TPH2基因的調(diào)控區(qū)，包括啟動區(qū)、非翻譯區(qū)及側(cè)翼序列，因此不會改變蛋白質(zhì)序列，但可能會參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在92922C/T位點的變異僅在1例樣本中檢出，說明該位點在中國北方漢族群體不具有遺傳多態(tài)性。另外，在rs41317118位點未檢出AA基因型，說明該基因型在中國北方漢族群體比較少見。通過連鎖分析發(fā)現(xiàn)，6個SNP位點連鎖不平衡系數(shù) D’絕對值介于 0.02～1.0，其中 rs4570625、rs11178997、rs11178998位點相互之間和rs41317118、rs17110747和rs41317114位點相互之間的D’值均為1.0，說明上述位點之間緊密連鎖。

根據(jù)TPH2基因5′、3′端SNP位點在中國北方漢族群體的分布情況，經(jīng)Halpoview v4.2軟件計算，TPH2基因5′端的3個SNP位點共構(gòu)成4種單倍型，分別為TTA、GTA、TAG和GAG，但單倍型GAG的頻率小于1%，因此推測TPH2基因5′端SNP位點主要構(gòu)成3種單倍型，這與Scheuch等[7]報道一致。TPH2基因3′端的3個SNP位點共構(gòu)成4種單倍型，分別為 GGG、GAG、GGC、AAG。

本實驗獲得的中國北方漢族群體TPH2基因5′、3′端SNP位點的等位基因頻率、基因型頻率以及單倍型頻率，并對相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 TPH2基因 5′、3′端 SNP 位點的法醫(yī)學(xué)意義

根據(jù)TPH2基因5′、3′端6個SNP位點在中國北方漢族群體的分布情況，計算出各位點及其單倍型的雜合度、多態(tài)信息含量、個體識別率及非父排除率。其中rs4570625位點的個體識別率為0.616、非父排除率為0.148，rs17110747位點的個體識別率為0.557、非父排除率為0.112，5′端3個SNP位點構(gòu)成的單倍型的個體識別率為0.792、非父排除率為0.252，3′端3個SNP位點構(gòu)成的單倍型的個體識別率為0.752、非父排除率0.239，說明上述兩個位點和兩種單倍型均具有較高的個體識別率和非父排除率，可用于法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定。

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