唐哲，孫玉坤，楊媛媛，何偉，張敬一（.武警遼寧省總隊醫(yī)院藥劑科，沈陽 004；.沈陽市蘇家屯區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，沈陽 00；.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽 006）

環(huán)孢素A（Cyclosporine A，CsA）為免疫抑制劑，是由11個氨基酸組成的中性環(huán)狀多肽，屬鈣調(diào)磷酸酶抑制劑家族。有報道[1]指出，CsA在藥動學、毒理學、敏感性和耐受性等方面存在著明顯的個體差異，而且治療指數(shù)較窄，引起這種差異的原因目前尚不十分清楚。臨床上，監(jiān)測免疫抑制劑的藥物濃度，可以更好地調(diào)整藥物使用劑量，以及減少藥品不良反應(yīng)發(fā)生。CsA的體內(nèi)藥物濃度和治療效果存在相關(guān)性[2]，因此，臨床上對其血藥濃度監(jiān)測是十分必要的。

P糖蛋白（P-gp）是由多藥耐藥基因（MDR1）編碼的一種產(chǎn)物，是一個膜蛋白，屬三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合家族。P-gp主要作用為能量依賴性地將作用底物由細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運至細胞膜外，起跨膜滲透泵的作用。當P-gp活性增加時，底物將大量被轉(zhuǎn)運至膜外，反之亦然?，F(xiàn)有文獻提示MDR1基因具有48個單核苷酸多態(tài)性（SNP），其中，有重要的功能意義的為第26外顯子C3435 T位點上的基因多態(tài)性，且不同種族間差異較大[3]。近年來，有關(guān)C3435 T基因多態(tài)性與CsA體內(nèi)代謝的相關(guān)性的報道已有很多，但有關(guān)中國朝鮮族腎移植術(shù)后患者CsA谷濃度與MDR1C3435 T位點的基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)性尚無報道。本文以75例腎移植術(shù)后患者（中國朝鮮族）為探討對象，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增MDR1 C3435 T基因，利用DNA限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法檢測了C3435 T的多態(tài)性，并探討了CsA的谷濃度與MDR1 C3435 T基因位點多態(tài)性之間的相關(guān)性，希望為臨床個體化用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ABI 2720 PCR擴增儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)（Gene Company）；TDxFLx/TDx免疫分析儀（珠海健民醫(yī)用科技有限公司）；Eppendorf 5804 R冷凍離心機（Gene Company）；DYY-6 C電泳儀（上海笛柏實驗設(shè)備有限公司）；HH-S恒溫水浴鍋（鄭州佳創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司）；V-32渦旋混合器（上海凌初科學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

提取基因組DNA試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司）；引物（廣州健侖生物科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶MboI與Taq酶（鄭州博美生物技術(shù)有限公司）；硼酸（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑北京有限公司）；瓊脂糖凝膠、溴化乙錠（EB）（北京奇松生物科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na2，純度＞99.0%）、無水乙醇（純度為99.7%）（北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法

2.1 研究對象

75例腎移植術(shù)后患者均為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院門診隨訪患者（中國朝鮮族），患者接受腎移植手術(shù)時間范圍為2001－2011年，全部為首次腎移植術(shù)。其中，男性42例，女性33例；年齡18～65歲，平均年齡（42.5±10.6）歲；體質(zhì)量41～106 kg，平均體質(zhì)量（67±9.8）kg。所有入組的患者均同時口服麥考酚酸嗎乙酯和CsA抗排斥治療，未出現(xiàn)嚴重感染或排斥反應(yīng)，手術(shù)時間＞0.5年。入選的患者在2周內(nèi)沒有服用過可能對CsA體內(nèi)代謝有影響的藥物，如促胃動力藥、H1受體拮抗藥、鈣離子拮抗藥、抗結(jié)核類藥、抗癲癇藥、大環(huán)內(nèi)酯類及四環(huán)素類抗生素等。

2.2 基因分型

提取人類基因組DNA:抽取200 μl靜脈血液，按照試劑盒說明提取DNA。MDR1 C3435 T基因序列的擴增:向反應(yīng)體系中加入10×Buffer 5 μl、dNTP 5 μl，根據(jù)文獻合成的引物[4]，即:10Pmol/μl上游與下游引物各2μl（上游引物:5′-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3′；下游引物:5′-ACATTA GGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3′）、DNA 樣品 2.5μl、Taq酶0.2 μl、雙蒸水18.3 μl，總體積30 μl。PCR反應(yīng)條件為:94℃預變性3 min，然后94℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。擴增的產(chǎn)物長度為248 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶MboI 37℃酶切4 h，65℃水浴滅活20 min。以2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，紫外成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2.3 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

MDR1 C3435 T基因片段PCR擴增后的產(chǎn)物為248 bp，電泳顯示結(jié)果如圖1。MDR1 C3435 T基因片段PCR擴增后的酶切產(chǎn)物如圖2[1、2、6、7為野生型等位基因（C/C型），產(chǎn)生172、60、16 bp 3個片段；3、4、5、8為雜合型（C/T型），產(chǎn)生238、172、60、16 bp 4個片段；9為突變型等位基因（T/T型），產(chǎn)生248、16 bp 2個片段；由于16 bp片段太短，已泳出凝膠板，故未能在圖中觀察到]。M為DNA標準品（Marker）。75例患者的基因分布頻率為C/C 31例（41.3%）、C/T 37例（49.3%）、T/T 7例（9.3%），等位基因頻率分別為C66%、T34%，具體見表1?；颊叩腗DR1C3435 T各基因型頻率經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，結(jié)果均符合遺傳平衡定律，說明研究對象符合群體代表性。

圖1 MDR1C3435T基因多態(tài)性經(jīng)PCR后電泳圖M.Marker；1～7.PCR產(chǎn)物Fig 1 Electrophoretogram of MDR1 C3435T gene polymorphism by PCRM.Marker；1-7.PCR products

圖2 MDR1C3435T基因多態(tài)性經(jīng)PCR-RFLP電泳圖M.Marker；1～9.PCR-RFLP產(chǎn)物Fig 2 Electrophoretogram of MDR1 C3435T gene polymorphism by PCR-RFLPM.Marker；1-9.PCR-RFLP products

在對表1分析中發(fā)現(xiàn)，P值均＞0.05，因此認為中國朝鮮族腎移植術(shù)后患者的MDR1C3435 T基因多態(tài)性對服藥劑量、CsA谷濃度及調(diào)整劑量濃度沒有顯著性影響。

4 討論

C3435 T基因多態(tài)性是最早進行研究的，也是目前為止認為最有可能影響MDR1編碼的P-gp功能表達，進而影響藥物在體內(nèi)的代謝。國外有學者認為，口服CsA吸收不完全、個體間吸收的差異大，主要與MDR1多態(tài)性有關(guān)[5-6]。由于免疫抑制劑CsA治療窗范圍較窄而藥動學參數(shù)的個體間差異較大，因此對器官移植患者服用CsA血藥濃度的監(jiān)測是有必要的。CsA的血藥濃度變化除了與個體的生理、病理因素有關(guān)外，還與遺傳（種族、性別、基因多態(tài)性）和環(huán)境（食物或聯(lián)合用藥）等因素有關(guān)[7]。有研究表明，80%的口服CsA血藥濃度的差異與肝臟細胞色素P4503 A（CYP3 A）和小腸P-gp的活性差異有關(guān)[3]?，F(xiàn)已證明C3435 T的SNP與P-gp的表達最為密切，Hoffmeyer S等[8]首先報道具有T/T型的健康白種人群中，P-gp的表達比其他基因型降低了2倍。國外對MDR1基因型和表型的關(guān)系進行了很多研究，但結(jié)論并不一致。法國學者采用大樣本腎移植病例研究顯示[9]，C1236 T對服用不同劑量CsA患者的ρmax、AUC0-4h有影響，統(tǒng)計學呈顯著性差異；而CYP3 A5*3、C3435 T、G2677 T/A和MDR1-129 T＞C則對不同劑量CsA的谷濃度、AUC0-12h、ρmax和AUC0-4h無顯著影響。亞洲人心臟移植病例的研究提示[10]，MDR1G2677 T/A、C3435 T、C1236 T對CsA谷濃度、AUC0-12h、AUC0-4h和ρmax無明顯影響；而CsA的劑量與基因類型的相關(guān)性卻存在于單倍體型TT-TT-TT、CC-GG-CC和CT-GT-CT之間，即CsA谷濃度、AUC0-12h、AUC0-4h和ρmax按照野生型純合子、雜合子、突變型純合子順序，依次增高[11]。因此，服用不同劑量CsA的谷濃度是否會受到MDR1、CYP3 A5和CYP3 A4等基因多態(tài)性的影響，意見還不統(tǒng)一，這可能與人種差異、性別、藥物劑量、劑型、疾病狀況等綜合因素影響有關(guān)。

表1 MDR1C3435T不同基因型患者各項參數(shù)比較（）Tab 1 Comparison of parameters in different C3435T gene types（）

表1 MDR1C3435T不同基因型患者各項參數(shù)比較（）Tab 1 Comparison of parameters in different C3435T gene types（）

與C/C基因型比較:＊P＞0.05vs.C/C gene type:＊P＞0.05

基因型C/C C/T T/T例數(shù)（占比，%）31（41.3）37（49.3）7（9.3）口服劑量，mg/（k g·d）3.62±1.893.73±1.22＊3.46±1.48＊Cs A谷濃度，n g/ml 173.85±79.53161.91±66.21＊190.45±73.89＊調(diào)整劑量濃度，n g/ml p e r mg/k g 51.60±23.4845.06±19.27＊59.35±25.46＊等位基因頻率C，%66 T，%34

C3435 T基因型的分布頻率在不同的人種中存在差異，Wang Y等[12]研究112例中國漢族人群C3435 T位點C/C、C/T和T/T型的分布頻率分別為37.5%、48.2%和14.3%，C等位基因頻率為61.6%，T等位基因頻率為38.4%。這與本研究結(jié)果相近，說明中國朝鮮族人群與中國漢族人群C3435 T基因多態(tài)性沒有很大差別。Ameyaw MM等[4]研究發(fā)現(xiàn)非洲人群C等位基因頻率明顯增高，這可能與非洲人群處于胃腸道疾病易感地區(qū)有關(guān)，是自然選擇的優(yōu)勢。

本文首次以中國朝鮮族腎移植術(shù)后患者為研究對象，考察了此人群MDR1中26外顯子C3435 T多態(tài)性與CsA谷濃度的關(guān)系。試驗結(jié)果提示，在現(xiàn)有采集樣本下，未發(fā)現(xiàn)MDR1 C3435 T基因多態(tài)性對CsA谷濃度有顯著性影響。這一結(jié)果與Wang Y等[12]就MDR1 C3435 T多態(tài)性對CsA劑量調(diào)整的谷濃度影響的研究結(jié)論相似，可以認為MDR1 C3435 T基因多態(tài)性可能不是影響CsA谷濃度的主要因素。

[1]王國俊，張青碧，孔伶俐.腎移植術(shù)后環(huán)孢素血藥濃度與患者體內(nèi)因素相關(guān)性分析[J].中國藥房，2008，19（23）:1795.

[2]王莉，盧一平，石明，等.腎移植術(shù)后應(yīng)用2種不同劑量環(huán)孢素A的臨床對照研究[J].中國藥房，2008，19（11）:844.

[3]Lown KS，Mayo RR，Leichtman AB，et al.Role of intestinal P-glycoprotein（mdr1）in interpatient variation in the oral bioavailability of cyclosporine[J].Clin Pharmacol Ther，1997，62（3）:248.

[4]Ameyaw MM，Regateiro F，Li T，et al.MDR1pharmacogenetics:frequency of the C3435 T mutation in exon 26is significantly influenced by ethnicity[J].Pharmacogenetics，2001，11（3）:217.

[5]W?hlby U，Jonsson EN，Karlsson MO.Comparison of stepwise covariate model building strategies in population pharmacokinetic-pharmacodynamic analysis[J].AAPS Pharm Sci，2002，4（4）:27.

[6]Zhang Y，Benet LZ.The gut as a barrier to drug absorption:combined role of cytochrome P4503 A and P-glycoprotein[J].Clin Pharmacokinet，2001，40（3）:159.

[7]Hashida T，Masuda S，Uemoto S，et al.Pharmacokinetic and prognostic significance of intestinal MDR1expression in recipients of living-donor liver transplantation[J].Clin Pharmacol Ther，2001，69（5）:308.

[8]Hoffmeyer S，Burk O，von Richter O，et al.Functional polymorphisms of the human multidrug-resistance gene:multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（7）:3473.

[9]Anglicheau D，Thervet E，Etienne I，et al.CYP3 A5and MDR1genetic polymorphisms and cyclosporine pharmacokinetics after renal transplantation[J].Clin Pharmacol Ther，2004，75（5）:422.

[10]Chowbay B，Cumaraswamy S，Cheung YB，et al.Genetic polymorphisms in MDR1and CYP3 A4genes in Asians and the influence of MDR1 haplotypes on cyclosporin disposition in heart transplant recipients[J].Pharmacogenetics，2003，13（2）:89.

[11]Anglicheau D，Verstuyft C，Laurent-Puig P，et al.Association of the multidrug resistance-1gene single-nucleotide polymorphisms with the tacrolimus dose requirements in renal transplant recipients[J].J Am Soc Nephrol，2003，14（7）:1889.

[12]Wang Y，Wang C，Li J，et al.Effect of genetic polymorphisms of CYP3 A5and MDR1on cyclosporine concentration during the early stage after renal transplantation in Chinese patients co-treated with diltiazem[J].Eur J Clin Pharmacol，2009，65（3）:239.