楊 開 薛介豐 金月忠 張安強(qiáng) 孫培龍

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310032）

松木層孔菌（Phellinus pini）又名松針層孔菌、松白腐菌，隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱，銹革孔菌目（Hymenochaetales），銹革孔菌科（Hymenochaetaceae），木層孔菌屬（Phellinus）。松木層孔菌子實(shí)體多糖具有較顯著的抗病毒活性[1]，其菌絲體多糖對(duì)小鼠離體淋巴細(xì)胞也有較顯著的促增殖作用[2]。在松木層孔菌多糖抗氧化方面，王穩(wěn)航等人對(duì)三種子實(shí)體多糖進(jìn)行了清除超氧陰離子、羥基自由基和丙二醛抑制的體外實(shí)驗(yàn)[6]及小鼠體內(nèi)抗氧化研究[7]。另外還有少數(shù)的酚類[8]和萜類[9]等成分的報(bào)道。

但與同屬的桑黃(Phellinus linteus)相比，目前有關(guān)松木層孔菌的研究還很少，也未見對(duì)其子實(shí)體多糖的提取工藝研究報(bào)道。本文以松木層孔菌子實(shí)體為原料優(yōu)化多糖微波輔助提取工藝，并研究體外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性。這不僅為松木層孔菌多糖的提取生產(chǎn)提供工藝條件，而且也為該珍稀藥用菌的醫(yī)藥保健品研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

儀器及生產(chǎn)廠家：MAS-Ⅱ微波萃取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；SHB-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW135中草藥粉碎機(jī)，上海將來實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Alpha 2-4 LD Plus真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；Spectra max M2多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

松木層孔菌子實(shí)體：采自黑龍江，浙江益圣菌物發(fā)展有限公司提供，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所吳學(xué)謙研究員鑒定。

2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH)，2,2-Azin-obis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diam-monium salt (ABTS)，2,4,6-Tris (2-pyridyl)-striazi-ne (TPTZ)，α-葡萄糖苷酶(Saccharomyces cerevisi-ae)，4-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranosidide (PNP-G)購自Sigma公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

松木層孔菌子實(shí)體切成小塊后粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，潔凈PE袋雙層密封后室溫干燥貯藏備用。

1.2.1 粗多糖提取流程。松木層孔菌子實(shí)體粉末60 ℃烘干至恒重，稱取10 g左右倒入1 L的玻璃燒瓶中，按比例加入水，設(shè)置相應(yīng)溫度后微波攪拌提取一定時(shí)間，5 000 r/min離心后取上清液，真空濃縮至原有體積的1/5左右后加入4倍體積95%食用級(jí)乙醇輕微攪拌后沉淀，靜置8 h以上，得醇沉物。醇沉物再經(jīng)無水乙醇、丙酮洗滌，72 h冷凍干燥后得松木層孔菌粗多糖。

1.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 綜合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及前期預(yù)試結(jié)果，本論文固定微波提取功率為600 W，設(shè)定料液比（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）為 3個(gè)主要影響因素，以總多糖提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.3 多糖提取率測(cè)定。多糖含量采用苯酚-硫酸法[10]測(cè)定，平行3次測(cè)定，再按以下公式計(jì)算提取率。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定?；诓煌目寡趸恚鞣N體外抗氧化活性檢測(cè)方法很多，目前常用的抗氧化活性檢測(cè)方法主要是基于自由基清除能力、抑制脂類氧化能力和樣品還原能力三種機(jī)理[11]。由于樣品體系的多樣性和復(fù)雜性，目前還尚未有統(tǒng)一的方法，而且每種方法存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)和局限性，所以一般要通過兩種以上的抗氧化方法來評(píng)價(jià)樣品的抗氧化性能[12]。本文采用了文獻(xiàn)[6]以外的DPPH、ABTS和FRAP三種常用方法來評(píng)價(jià)松木層孔菌粗多糖的抗氧化活性。

（1）清除 DPPH自由基活性測(cè)定。測(cè)定方法參考Milardovic[13]的報(bào)道并略有改動(dòng)。用80%甲醇溶液配制成0.2 mmol/L的DPPH試劑，取1 mL稀釋的提取液與3 mL DPPH試劑混合，暗處反應(yīng)1 h，然后在515 nm下測(cè)定吸光值。以80%甲醇溶液作為空白對(duì)照。其結(jié)果表達(dá)為清除率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的多糖濃度（即EC50）。

其中，A0為空白對(duì)照的吸光值；A1為樣品的吸光值。下同。

（2）清除 ABTS自由基活性測(cè)定。測(cè)定方法參考 Miller[14]的報(bào)道并略作修改。取 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液加入到 7 mmol/L的ABTS溶液中混合，暗處反應(yīng)12～16 h。測(cè)定前用無水乙醇將ABTS·+溶液稀釋至吸光值為0.70 ±0.02（734 nm下）。取0.2 mL稀釋過的提取液與3.8 mL的 ABTS·+溶液混合搖勻，在室溫下反應(yīng)10 min后，在734 nm下測(cè)定吸光值。以80%甲醇溶液作為空白對(duì)照。其結(jié)果表達(dá)為清除率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的多糖濃度（即EC50）。

（3）FRAP總抗氧化活性測(cè)定。測(cè)定方法參考Benzie[15]的報(bào)道并略有修改。FRAP試劑的準(zhǔn)備：將 0.1 mol/L的醋酸緩沖試劑（pH3.6）、19 mmol/L 的TPTZ、20 mmol/L氯化鐵，按體積比10︰1︰1混合。3.9 mL FRAP試劑工作液加入0.1 mL稀釋過的提取液，混合均勻，置于37 ℃恒溫水浴中10 min，然后在593 nm下測(cè)其吸光值。以 FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)反應(yīng)后的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)的FeSO4濃度，定義為FRAP值，結(jié)果以每毫克多糖相當(dāng)FeSO4還原力的相當(dāng)量表示（mmol FeSO4/mg多糖），F(xiàn)RAP值愈大，抗氧化活性愈強(qiáng)。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定。測(cè)定方法參考 Dong[16]的報(bào)道并略作修改。將 α-葡萄糖苷酶溶于pH 6.8、0.1 mol/L磷酸緩沖液配成1 U/mL酶液，PNPG溶于相同緩沖液配成5 mmol/L底物液，整個(gè)檢測(cè)在96微孔板上進(jìn)行。取60 μL樣品、50 μL酶液在37 ℃下保溫10 min，再加入5 mmol/L PNPG 反應(yīng) 20 min，用 160 μL 0.2 M Na2CO3終止酶反應(yīng)。最后在酶標(biāo)儀上405 nm處測(cè)定吸光值，以磷酸緩沖液作為空白對(duì)照。其結(jié)果表達(dá)為抑制率達(dá)到 50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的多糖濃度（即IC50）。

其中，Asample為樣品的吸光值；Asampleblack為無底物時(shí)樣品的吸光值；Acontrol為空白的吸光值；Acontrolblack為無底物時(shí)空白的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)時(shí)平行3次測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0的ANOVA進(jìn)行鄧肯氏（Duncan’s）差異分析，以P＜0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化多糖提取工藝

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以松木層孔菌的多糖提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

利用Design-Expert 8軟件對(duì)表1中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，其分析結(jié)果見表2、表3?；貧w方差分析表明，該模型極顯著（P＜0.0001），模型的R2=0.9749，AdjR2=0.9427，說明模型的擬合程度較好，可用于松木層孔菌多糖提取工藝實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

利用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到多糖提取率 Y（%）對(duì) A:料液比（液體量）、B:提取溫度（℃）、C:提取時(shí)間（min）的回歸方程如下：

表2 方差分析

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.2 各因素間的交互作用

根據(jù)上述的回歸分析結(jié)果，采用軟件Design-Expert 8對(duì)回歸方程分析作響應(yīng)面，生成相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，以確定料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖 1～3所示，結(jié)合方差分析結(jié)果表明：FA=10.79，F(xiàn)B=128.06，F(xiàn)C=21.65，各因素的F值越大，則說明該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響愈大，即重要性愈大。由此可見，各因素對(duì)松木層孔菌多糖提取率的影響程度大小為：B（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）＞A（料液比）。

2.3 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，通過Design-Expert 8軟件求解多糖提取率的最大值，得到松木層孔菌多糖提取的最佳條件為：料液比1︰39.92，提取溫度91.85 ℃，提取時(shí)間59.88 min，預(yù)測(cè)多糖的提取率達(dá)到 3.46 %。為檢驗(yàn)響應(yīng)面模型的可靠性，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，綜合確定最佳條件為：料液比為1︰40，提取溫度為92 ℃，提取時(shí)間為60 min。在此條件下3次平均的多糖提取率為 3.33%，與理論值的誤差為 3.76%，理論值與實(shí)際值基本相符。因此，響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)較準(zhǔn)確，具有較好的參考價(jià)值。

圖1 料液比與提取溫度對(duì)多糖提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖2 料液比與提取時(shí)間對(duì)多糖提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖3 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)多糖提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

2.4 提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上最佳提取條件，進(jìn)行了提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)，前次提取所得濾渣進(jìn)行下一次提取，共進(jìn)行了3次提?。ㄖ貜?fù)3次），單次提取率分別是 3.33±0.16%、0.55±0.17%、0.21±0.01%。其中，第1次提取時(shí)多糖平均提取率可達(dá)3.33%，第2次降為0.55%，第3次僅為0.21%，按3次總和計(jì)算，有94.8%的多糖在前2次就可提取完全，為減少后期蒸發(fā)濃縮和超濾等操作，提取次數(shù)以2次為宜。

2.5 體外活性測(cè)定結(jié)果

松木層孔菌多糖體外抗氧化和 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 松木層孔菌多糖抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)果

發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，松木層孔菌多糖對(duì) DPPH?和 ABTS·+自由基的清除率均隨濃度增加而增加，呈量效關(guān)系，對(duì)DPPH?自由基的半清除濃度（EC50）為 2.59 mg/mL，高于雞油菌[17]粗多糖清除DPPH?的EC50值（0.92 mg/mL）；對(duì)ABTS·+自由基的半清除濃度（EC50）為 6.44 mg/mL，高于DPPH的EC50值，也高于尖頂羊肚菌[18]胞外多糖提取物的清除 ABTS·+值；反映總抗氧化能力的FRAP值為0.27 mmol FeSO4/mg多糖。對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定的多糖濃度范圍內(nèi)，該多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用也呈量效應(yīng)關(guān)系，半抑制濃度（IC50）為2.17 mg/mL，其效果要低于同屬的樺褐孔菌多糖[19]，而優(yōu)于陽性對(duì)照阿卡波糖（IC50=4.26 mg/mL）。

3 討 論

本文采用微波輔助提取松木層孔菌子實(shí)體多糖，Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝，影響松木層孔菌多糖提取率的因素依次為：提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比，綜合確定的優(yōu)化提取工藝條件為：微波功率600 W，料液比1︰40，提取溫度92 ℃，提取時(shí)間60 min。經(jīng)80%乙醇沉淀，二次提取，在此條件下松木層孔菌的多糖累計(jì)提取率為3.88%。

采用DPPH、ABTS、FRAP三種方法測(cè)定松木層孔菌多糖的體外抗氧化活性，結(jié)果表明，松木層孔菌粗多糖具有一定的抗氧化活性，有待對(duì)其中具抗氧化活性的多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行更深入的純化及鑒定等研究。該多糖還顯示了一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可能具有潛在降血糖功能，需作構(gòu)效關(guān)系研究予以證實(shí)。

[1]裴麗娟, 袁 雷, 馬姣妮, 等. 松木層孔菌多糖 PEP的結(jié)構(gòu)及活性研究[J]. 分子科學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(2): 103-107.

[2]Lee M S, Kim S M, Lee Y H, et al. Macromolecules isolated from Phellinus pini fruiting body: chemical characterization and antiviral activity[J]. Macromolecular Research, 2010, 18(6): 602-609.

[3]李 樂, 宋 敏, 袁 芳, 等. 食用菇類中抗氧化活性物質(zhì)的研究[J]. 南開大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 40(6):62-66.

[4]Kozarski M, Klaus A, Niksic M, et al. Antioxidative and immunomodulating activities of polysaccharide extracts of the medicinal mushrooms Agaricus bisporus，Agaricus brasiliensis，Ganoderma lucidum and Phellinus linteus[J].Food Chemistry, 2011, 129(4): 1667-1675.

[5]Huang S Q, Ding S, Fan L. Antioxidant activities of five polysaccharides from Inonotus obliquus[J]. Internation Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50(5):1183-1187.

[6]王穩(wěn)航, 李 玉, 劉安軍. 松木層孔菌多糖的提取及抗氧化性研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(11): 53-56.

[7]王穩(wěn)航, 李 玉, 劉安軍. 松木層孔菌多糖對(duì)正常小鼠體內(nèi)抗氧化功能的影響[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008,8(8): 1439-1464.

[8]Ayer W A, Muir D J, Chakravarty P. Phenolic and other metabolites of Phellinus pini, a fungus pathogenic to pine[J]. Phytochemistry, 1996, 42(5): 1321-1324.

[9]Park P H, Hur J, Lee D S. Inhibition of nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages by diterpenoids from Phellinus pini [J]. Archives of Pharmacal Research,2011, 34(6): 913-917.

[10]張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù) [M]. 杭州：浙江大學(xué)出版社, 1999.

[11]Lee I K, Kim Y S, Jang Y W, et al. New antioxidant polyphenols from the medicinal mushroom Inonotus obliquus[J]. Bioorganic﹠Medicinal Chemistry Letters,2007, 17(24): 6678-6681.

[12]Santas J, Carbo R, Gordon M H, et al. Comparison of the antioxidant activity of two Spanish onion varieties [J].Food Chemistry, 2008, 107(3): 1210-1216.

[13]Milardovic S, Ivekovic D, Grabaric B S. A novel amperometric method for antioxidant activity determination using DPPH free radical[J].Bioelectrochemistry, 2006, 68(2): 175-180.

[14]Miller N J, Rice Evans C，Davies M J, et al. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring antioxidant status in premature neonates[J]. Clinical Science, 1993, 84(4): 407-412.

[15]Benzie I F F, Strain J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP)as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-76.

[16]Dong H Q, Mei L, Feng Z, et al. Inhibitory potential of trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd against α-amylase linked to type 2 diabetes [J]. Food Chemistry,2012, 130(2): 261-266.

[17]靳文娟, 魯曉翔. 超聲波法提取雞油菌多糖及其抗氧化性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)學(xué), 2011, 39(27): 16545-16547.

[18]潘志福, 蘭 瑛, 張 松. 尖頂羊肚菌胞外多糖提取物抗氧化作用的研究[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011, (2): 124-128.

[19]Chen H X, Lu X M, Qu Z S, et al. Glycosidase inhibitory activity and antioxidant properties of a polysaccharide from the mushroom Inonotus Obliquus[J]. Journal of Food Biochemistry, 2010, 34(SUPPL. 1): 178-191.