朱永香 王 倩 王 爽 于 瑋 南 瑛 曹 健

(西安醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，陜西 西安 710021)

Ghrelin是由28個氨基酸殘基組成的多肽，具有強烈的促食欲作用。最初發(fā)現(xiàn)Ghrelin主要是由胃底泌酸腺的X/A樣細胞產(chǎn)生，但后來Cowley等〔1〕報道腦內(nèi)尤其是下丘腦也能夠合成Ghrelin，而其陽性突起在下丘腦以外的腦區(qū)也有分布，包括:杏仁中央核(CeA)、終紋床核、內(nèi)側(cè)杏仁核、杏仁皮質(zhì)核以及丘腦室旁核等部位。生長激素促分泌素受體(GHS-R)是Ghrelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮作用的受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布包括下丘腦、腦干以及邊緣系統(tǒng)的一些腦區(qū)〔2〕。盡管最初并未發(fā)現(xiàn)CeA內(nèi)有GHS-R的存在，但近來有研究用qRT-PCR方法檢測到CeA內(nèi)有GHS-R mRNA存在〔3，4〕。CeA是參與攝食行為調(diào)節(jié)的核團之一，已有研究證實下丘腦外側(cè)區(qū)或室旁核注射Ghrelin激活了CeA內(nèi)的神經(jīng)元〔5，6〕。然而，至今并未發(fā)現(xiàn)Ghrelin在CeA內(nèi)對攝食調(diào)節(jié)作用的研究。本研究應(yīng)用核團內(nèi)注射的方法觀察了給飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin對攝食量的影響及對弓狀核c-Fos表達的影響;并觀察了給隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑D-Lys3-GHRP-6對攝食量的影響，擬探討外源性及內(nèi)源性Ghrelin在CeA內(nèi)對攝食的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 48只雄性 SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證:SCXK(陜)2008-002，使用許可證:SYXK(陜)2008-005。大鼠自由攝食飲水，室溫22～24℃。多克隆兔抗大鼠c-Fos抗體購自美國Santa Cruz公司，Ghrelin和GHS-R受體阻斷劑D-Lys3-GHRP-6均購自美國Sigma公司，SP試劑盒(羊抗兔)及DAB濃縮型試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要儀器有大鼠腦立體定位儀(SN-3)、顯微鏡(Olympus，BX51)、照相機(Spot Insight，U3.5)及圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)。

1.2 CeA內(nèi)植入套管 將大鼠腹腔注射水合氯醛(40 mg/kg)麻醉，固定于立體定位儀上，將自制鋼套管植入左側(cè)CeA上方1 mm處(根據(jù)包新民大鼠腦立體定位圖譜:前囟后2.2 mm，向左旁開4.5 mm，硬腦膜下6.5 mm)，并用牙科水泥固定。術(shù)后恢復(fù)8 d，痊愈后實驗，狀態(tài)差者排除實驗。

1.3 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的觀察 將16只術(shù)后大鼠隨機分為兩組，每組8只，自由攝食，分別用微量注射器向CeA內(nèi)注射(在套管下1.0 mm處持續(xù)2 min，停留2 min)生理鹽水(對照組)或Ghrelin 0.3 nmol(實驗組)，分別測量1、2、4 h內(nèi)大鼠的攝食量。

1.4 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后弓狀核內(nèi)c-Fos表達的觀察 將16只手術(shù)后大鼠隨機分為對照組和實驗組，每組8只并自由攝食，分別用微量注射器向CeA內(nèi)注射生理鹽水(對照組)或Ghrelin 0.3 nmol(實驗組)，2 h后灌流固定，斷顱取腦固定后，做冰凍冠狀切片，片厚40μm。SP免疫組織化學(xué)染色檢測弓狀核內(nèi)c-Fos蛋白的表達。細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。在400倍光鏡下，選取有弓狀核的連續(xù)5張切片，并選取同一區(qū)域拍照，應(yīng)用IPP6.0軟件分析FOS陽性細胞數(shù)。

1.5 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的觀察 將16只手術(shù)后大鼠隨機分為2組，每組8只，隔夜禁食后，分別用微量注射器向CeA內(nèi)注射生理鹽水(對照組)或GHS-R阻斷劑D-Lys3-GHRP-6 200 nmol(實驗組)后，測量1、2及4 h內(nèi)大鼠的攝食量。

1.6 套管位置鑒定 實驗結(jié)束后用20%烏拉坦(1 mg/kg)腹腔注射麻醉，CeA內(nèi)注入旁胺天藍0.5μl，灌流固定，開顱取腦，置入10%甲醛中后固定。24 h后做連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚50μm，光鏡下參照大鼠腦定位圖譜對套管位置進行定位，排除位置不準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t檢驗。

表2 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化，mg，n=8)

表2 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化，mg，n=8)

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圖1 大鼠弓狀核內(nèi)c-Fos免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(SP，×400)

2 結(jié)果

2.1 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的變化 實驗組與對照組比較，1、2、4 h內(nèi)的攝食量明顯增加(P＜0.05)。見表1。

表1 CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的變化，mg，n=8)

表1 CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的變化，mg，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;表2同

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2.2 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后弓狀核內(nèi)c-Fos表達的變化 對照組弓狀核內(nèi)c-Fos免疫反應(yīng)陽性細胞表達較少，平均值為46.13±9.14，實驗組弓狀核內(nèi)c-Fos免疫反應(yīng)陽性細胞表達較多，平均值為93.88±21.09，與對照組比較差異顯著(P＜0.05)。見圖1。

2.3 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化 實驗組與對照組相比，1、2、4 h內(nèi)的攝食量明顯減少(P＜0.05)。見表2。

3 討論

Ghrelin是GHS-R的內(nèi)源性配體，具有強烈的刺激攝食的作用。盡管胃是血液循環(huán)中Ghrelin的主要來源，并且外周注射Ghrelin可以產(chǎn)生強烈的攝食反應(yīng)。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對Ghrelin的攝食調(diào)控發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。給大鼠下丘腦的多個核團內(nèi)如:弓狀核、下丘腦外側(cè)區(qū)、下丘腦室旁核以及腦干注射Ghrelin均可發(fā)動攝食行為;另外，給中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、伏核、海馬以及中縫背核注入Ghrelin同樣也出現(xiàn)了刺激攝食的作用〔7，8〕。由于Ghrelin突起及其受體GHS-R在CeA內(nèi)均有存在〔1，3，4〕，并且 CeA 對攝食具有調(diào)控作用，可增加進食量，有理由推測Ghrelin在CeA內(nèi)可能同樣參與了攝食調(diào)節(jié)作用。

當(dāng)機體處于饑餓狀態(tài)時，下丘腦內(nèi)GHS-R mRNA表達上調(diào)，血漿中Ghrelin濃度升高，餐后血漿中Ghrelin水平降低。本研究結(jié)果提示Ghrelin在CeA內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)具有促進攝食的作用。但有研究指出給大鼠杏仁基底外側(cè)核注射Ghrelin卻使液體食物的攝入量減少〔9〕，其原因可能是CeA和杏仁基底外側(cè)核在攝食調(diào)控中起不同的功能，CeA起正調(diào)控作用，可增加進食量;杏仁基底外側(cè)核則起負調(diào)控作用，可減少攝食量。然而，也有研究顯示杏仁核內(nèi)注射Ghrelin對常規(guī)飼料的攝入無明顯影響〔10〕，其原因可能是由于Ghrelin注射進入杏仁核不同的亞核，對攝食產(chǎn)生了或增加或降低的影響，綜合以后可能作用相互抵消，從而導(dǎo)致攝食沒有明顯變化。

弓狀核是下丘腦調(diào)節(jié)攝食的主要部位，腹腔、腦室及下丘腦外側(cè)區(qū)注射Ghrelin均能夠使弓狀核內(nèi)的神經(jīng)元激活，表明弓狀核在Ghrelin的攝食調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究給飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin導(dǎo)致弓狀核內(nèi)c-Fos表達也增多，其原因可能是Ghrelin注射入CeA后與該核團內(nèi)GHS-R結(jié)合，導(dǎo)致CeA內(nèi)相應(yīng)的神經(jīng)元激活，從而間接激活了與CeA有纖維聯(lián)系的弓狀核。前面提及下丘腦室旁核或外側(cè)區(qū)注射Ghrelin能夠激活CeA內(nèi)的神經(jīng)元〔5，6〕，由此推測在CeA與下丘腦參與攝食調(diào)節(jié)的一些核團之間可能存在復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路，使這些核團相互聯(lián)系共同參與Ghrelin對攝食的調(diào)節(jié)作用，但仍需進一步證實CeA與下丘腦參與攝食調(diào)控的核團之間存在Ghrelin能神經(jīng)纖維投射。大量研究證實禁食使機體內(nèi)Ghrelin水平顯著提高，從而產(chǎn)生強烈的攝食驅(qū)動作用〔11〕。給禁食大鼠腦室注射GHS-R阻斷劑抑制了饑餓大鼠的攝食〔12〕，提示內(nèi)源性Ghrelin在饑餓引起的攝食中具有重要作用。本研究結(jié)果提示內(nèi)源性Ghrelin在CeA內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與攝食調(diào)控有關(guān)，尤其是與能量不足導(dǎo)致的攝食行為有關(guān)。

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