陳志偉 梅慶步 張 琪 許惠玉 鄭立紅

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蒺藜為傳統(tǒng)中藥，蒺藜科(Zygophylaceae)蒺藜屬，植物蒺藜(Tribulus terrestris L.)的干燥成熟果實，性微溫，味辛苦，有小毒，主要成分是蒺藜皂苷。蒺藜皂苷具有抗衰老，促進免疫功能增強和降血脂、血壓等功效〔1，2〕。近些年發(fā)現(xiàn)蒺藜皂苷類成分具有很好的抗腫瘤及誘導細胞凋亡的功效〔3〕。卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的疾病之一。目前臨床采用腫瘤細胞減滅術與多種化療方案相結(jié)合，但是其5年存活率沒有明顯改善。臨床上常用的治療卵巢癌的化療藥物副作用較大，而且容易出現(xiàn)耐藥問題。本研究通過體外實驗探討蒺藜皂苷對腫瘤細胞生長的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng) 人卵巢癌細胞株SKOV3(購自于中國科學院上海生物科學研究所)培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清、100 U/ml青霉素的RPMI1640(GIBCO公司生產(chǎn))培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 Bax和Bcl-2免疫組化試劑盒，DAB顯色劑(武漢博士德有限公司)。環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn))。HIMAS-1000病理圖文分析系統(tǒng);流式細胞儀(FACScan，Beckman公司)。蒺藜皂苷(陜西森弗生物技術有限公司，純度達98%)，應用前以純凈水配成所需濃度。

1.3 MTT法檢測細胞活性 取處于對數(shù)生長期的細胞，調(diào)細胞濃度至1×105個/ml，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，待細胞貼壁后環(huán)磷酰胺組加環(huán)磷酰胺100 mg/L，200μl;實驗組加入100 mg/L蒺藜皂苷藥液200μl，對照組加入等體積的無菌注射用水。在37℃、50%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，分別于24、48、72 h終止培養(yǎng)。在培養(yǎng)終止前4 h加入MTT 10μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 g/L SDS100μl終止培養(yǎng)，37℃過夜，全自動酶標儀測定570 nm波長處吸光度A值，計算細胞生長抑制率(IR)。抑制率(%)=(A對照－A試驗)/A對照×100%。

1.4 流式細胞術(FCM)檢測蒺藜皂苷對卵巢癌細胞周期的影響 取70%冷乙醇固定的細胞樣品，用PBS洗2次去除殘留的乙醇，加碘化丙錠染液(4℃、避光30 min)，用流式細胞儀檢測細胞周期的變化，測定凋亡率。

1.5 免疫組化測定Bcl-2及Bax蛋白表達 取各組對數(shù)生長細胞1×105個/ml涂片，3%H2O2室溫封閉10 min，PBS沖洗，浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，高壓后冷卻至室溫。具體按常規(guī)SP法操作。Bcl-2、Bax抗體為單克隆抗體(1∶100)，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。用Image-ProPlus分析軟件進行圖像分析，每組涂片取10個視野測定腫瘤細胞Bcl-2和Bax蛋白陽性產(chǎn)物的積分吸光度，取平均值代表Bcl-2和Bax蛋白表達強度，吸光度值越大表示陽性產(chǎn)物表達越強。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料比較用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞抑制率的比較 與對照組(0)相比，實驗組(61.6%)及環(huán)磷酰胺組(55.4%)對卵巢癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用(P＜0.05)。

2.2 各組細胞細胞周期變化的比較 與對照組比較，實驗組使卵巢癌細胞的S期細胞比例減小，G1期細胞比例增大(P＜0.05)。見表1。

表1 各組細胞周期變化的比較，%，n=10)

表1 各組細胞周期變化的比較，%，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05;下表同

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2.3 各組細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的比較 與對照組比較，蒺藜皂苷能夠降低 Bcl-2蛋白表達(P＜0.05)，增加Bax蛋白表達 (P＜0.01)。見表2，圖1。

表2 各組細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的比較，n=10)

表2 各組細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的比較，n=10)

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圖1 各組Bcl-2和Bax水平比較(免疫組化)

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，蒺藜皂苷對卵巢癌細胞系SKOV-3具有明顯抑制作用，能有效誘導細胞凋亡，且蒺藜皂苷誘導的細胞凋亡與下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax蛋白調(diào)節(jié)有關。

研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子。Bcl-2阻止或降解細胞皺縮、DNA裂解和染色質(zhì)濃縮，在細胞凋亡的早期發(fā)揮作用〔4〕。Bcl-2過度表達后可抑制由于興奮性氨基酸、氧自由基、鈣超載等誘發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡，阻斷細胞色素C(Cyt C)釋放，阻止 Caspase 活化，從而抑制凋亡〔5，6〕。Bax 是Bcl-2家族中的促死亡基因，與Bcl-2結(jié)合成異二聚體是Bcl-2發(fā)揮抗凋亡活動的前提。細胞當外界刺激時，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間協(xié)同作用，共同決定細胞是否進入凋亡程序〔7〕。

細胞周期紊亂是幾乎所有腫瘤的共同特點之一，而許多抗腫瘤藥物都可以通過對細胞周期的阻滯作用將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期或G2/M期，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。

本研究表明蒺藜皂苷能明顯抑制卵巢癌細胞的增殖，通過有效增加Bax蛋白和降低 Bcl-2蛋白表達啟動細胞凋亡，在腫瘤的治療領域有著良好的應用前景。

1 李君玲.蒺藜皂苷化學及藥理研究概述〔J〕.中醫(yī)藥學刊，2006;24(8):1509-10.

2 孫 端.中藥有效成分在抗腫瘤治療中的應用〔J〕.浙江大學學報:B卷英文版，2008;9(9):585-6.

3 Hye Jin Kin，Jin Chul Kim，Jung Sun Min，et al.Aqueous extract Tribulus terrestris Linn induces cell growth arrest and apoptosis by down-regulating NF-κB signaling in liver cancer cells〔J〕.Ethnopharmacol，2011;136:197-203.

4 Yang LQ，F(xiàn)ang DC，Wang RQ，et al.Effect of NF-kappa B，survivin，Bcl-2 and Caspase-3 on apoptosis of gastric cancer cells induced by tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(1):22-5.

5 Norberg E，Orrenius S，Zhivotovsky B.Mitochondrial regulation of cell death:processing of apoptosis-inducing factor(AIF)〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2010;396(1):95-100.

6 張正茂，王夢華，楊雪梅，等.格爾德霉素對人卵巢癌細胞SKOV3增殖和凋亡的影響及其機制探討〔J〕.腫瘤，2011;31(10):899-905.

7 Chen S，Cooper M，Jones M，et al.combined activity of oridonin and wogonin in advanced-stage ovarian cancer cells:sensitivity of ovarian cancer cells to photoactive chemicals〔J〕.Cell Biol Toxicol，2011;27(2):133-47.