鄭 旸，康曉平，楊銀輝

RNA干擾機制及在病毒檢測領(lǐng)域的應用

鄭 旸，康曉平，楊銀輝

RNA干擾；病毒檢測

近年來，有關(guān)RNA干擾的機制及應用成為生命科學領(lǐng)域的研究熱點。RNA干擾的應用已經(jīng)從基因組學研究逐步擴展到醫(yī)學領(lǐng)域。利用RNA干擾不僅能提供一種經(jīng)濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術(shù)，在諸多領(lǐng)域如病毒的檢測方面也具有非常廣闊的應用前景。

1 RNA干擾現(xiàn)象及其機制

1.1 RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 1990年初，Napol i等[1]在矮牽牛花中導入與花青素合成有關(guān)的查爾酮合成酶基因，本以為轉(zhuǎn)基因的牽?；〞兊酶r艷，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，一些花反而被漂白了。這種過度表達內(nèi)源基因而引發(fā)的基因沉默被稱為共阻遏。Carvalho等[2]在純合子植物、Brusslan等[3]在擬南芥屬、Angenent等[4]在喇叭花中又相繼發(fā)現(xiàn)了類似的共阻遏現(xiàn)象，即內(nèi)源和外源轉(zhuǎn)入的基因轉(zhuǎn)錄本在轉(zhuǎn)錄后水平都顯著減少，出現(xiàn)明顯的基因沉默現(xiàn)象。除了植物，1992年Romano等[5]在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)了外源導入基因可以抑制具有同源序列的內(nèi)源基因的表達，1995年，Guo等[6]在線蟲中也發(fā)現(xiàn)了類似的基因沉默現(xiàn)象。1998年Fire等[7]發(fā)現(xiàn)所謂的基因沉默現(xiàn)象是由于部分mRNA被同源的dsRNA降解，導致相關(guān)基因的表達受到抑制，他們正式將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾。而Fire等也由于在RNA干擾研究中的貢獻獲得2006年的諾貝爾生理及醫(yī)學獎。

1.2 RNA干擾的機制 RNA干擾（RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。RNAi與轉(zhuǎn)錄后基因沉默在分子層次上被證實是同一種現(xiàn)象，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。RNAi是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式，是生物界古老而且進化的高度保守的現(xiàn)象之一。

外源dsRNA進入細胞后可被宿主RNA干擾機制識別，進而募集核酸內(nèi)切酶將dsRNA剪切加工為小干擾RNA（siRNA），產(chǎn)生的siRNA的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復合物（RISC），RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用從而介導RNA干擾的過程，見圖1。

圖1 細胞內(nèi)的RNA干擾機制圖

2 RNAi的種類及其作用機制

RNAi現(xiàn)象是由生物體內(nèi)一類非編碼的雙鏈小RNA所介導的，而內(nèi)源小RNA種類各異，主要可歸納為3類：miRNA（microRNA）、siRNA和piRNA（piwiRNA）。針對miRNA和siRNA的研究起步較早，研究也較為深入。自2006年發(fā)現(xiàn)piRNA后又一次掀起了小RNA研究的熱潮[8]。本文著重介紹miRNA和siRNA。

2.1 miRNA miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈 RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控。miRNA能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控。miRNA在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的l in-4和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNA。

miRNA與靶mRNA的作用模式有如下幾種：當二者不完全互補，即二者不完全配對結(jié)合時，主要影響翻譯過程而對mRNA的穩(wěn)定性無任何影響[9]（哺乳動物中比較普遍），如線蟲的l in-4。然而，最近也有證據(jù)表明，有些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性，這類miRNA的結(jié)合位點通常在mRNA的3′端非編碼區(qū)。當二者完全互補，即二者完全配對結(jié)合后，類似siRNA與靶mRNA的結(jié)合，特異性地切割mRNA（在植物中比較常見），如miR39/miR171。此時miRNA也能像siRNA一樣識別切割靶mRNA[10]。通過這種機制作用的miRNAs結(jié)合位點通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。

2.2 siRNA siRNA也是一種長度為21～25 nt的小RNA，其中包括5個磷酸鹽、2個核苷和3個懸臂，在RNA沉默過程中起主要作用。siRNA和miRNA均屬于非編碼RNA（ncRNA），且都是長度約21～25 nt的小分子RNA（smal l RNA），二者關(guān)系密切。雖然siRNA和miRNA非常相似，但是它們的產(chǎn)生途徑、功能以及對靶RNA的作用都是有所區(qū)別的。對siRNA和miRNA進行比較[11]，見表1。

正如前面提到的miRNA與靶mRNA的作用模式中，miRNA有一種作用模式類似于siRNA與靶mRNA的結(jié)合，同樣，Doench等[12]發(fā)現(xiàn)，在siRNA與靶RNA的作用模式中，也有一些siRNA可以像miRNA那樣，它主要影響翻譯過程，抑制基因的表達而不影響mRNA的穩(wěn)定性。因而miRNA與siRNA之間并不存在嚴格意義上的界限，既有個性也有共性。

另外，Pak等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在RNA干擾過程中，存在一類特殊的小RNA群體，即次級siRNA，能導致不同種群之間出現(xiàn)不同的初級和次級效應。同時，Si jen等[14]發(fā)現(xiàn)幾個次級siRNA序列開始于一些初級siRNA下游，因而推測次級siRNA是一種不同類型的小RNA，其產(chǎn)生依賴于RNA聚合酶（RdRP）。在線蟲中，初級siRNAs可作為RdRP的模板產(chǎn)生次級siRNAs。這種信號放大過程是線蟲的RNAi效應所必需的[15-16]。

3 RNAi在病毒檢測領(lǐng)域的應用

自從發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來，RNAi一直是生命科學研究的熱點。RNAi作為后基因組時代的一種下調(diào)基因表達的工具已被廣泛用于基因功能的研究、疾病的診斷、基因治療、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和病原微生物檢測等方面，下面我們以病毒為例，著重闡述一下RNAi在病毒檢測方面的應用。

RNAi是節(jié)肢動物抗病毒的關(guān)鍵機制，蟲媒病毒的感染能夠誘發(fā)RNAi機制，近些年關(guān)于RNAi的研究多見于病毒致病或者宿主抗病毒的機制研究，極少應用于病原微生物檢測等方面。Myles等[17]研究表明，蟲媒病毒在自然界中的維持需要一個生物鏈循環(huán)，脊椎動物和無脊椎動物（包括蚊等）對于病毒入侵產(chǎn)生的響應不同。病毒在人和節(jié)肢動物中導致了較為明顯的發(fā)病率和死亡率，而在蚊蟲體內(nèi)卻存在著一種抗病毒的RNAi機制，限制了病毒的復制。他們在感染病毒的蚊體內(nèi)獲得了長度為21 nt的病毒源性siRNAs，它們橫跨了整個病毒的基因組并且有著不對稱的分布，研究結(jié)果表明一個外生的siRNA途徑對于感染病毒的蚊來說是至關(guān)重要的，也是某些病毒能夠在自然界中維持的原因。Orban等[18]研究了在果蠅細胞中被RISC作為目標的mRNA的降解途徑，長的dsRNA分子首先要被核酸內(nèi)切酶加工成21～22 nt的siRNAs，它們被結(jié)合成RISC，并利用互補性來裂解mRNA。Myles等[19]同樣發(fā)現(xiàn)許多蟲媒病毒在自然界中的持續(xù)傳播依靠的是一個固定的、無病毒感染的蚊載體的確立，進一步表明了蚊中由小RNA指導的抗病毒免疫的重要性，同時導致RNA沉默的這些小RNA的起源也成了討論的話題。最后他們總結(jié)出了一些證據(jù)表明蚊蟲中甲病毒在復制過程中產(chǎn)生的雙鏈中間體引發(fā)了一種外生的siRNA途徑，也就成了病毒源性siRNAs的起源。

表1 siRNA和miRNA的比較

Nakamura等[20]應用了一種新的高通量測序的方法對他們采集到的鼻咽和排泄物樣本中的病毒進行了檢測，實驗結(jié)果表明了他們的高通量測序方法是有效的，可以不需要進一步的遺傳信息。盡管主要的讀長是宿主源性基因組，但是所測得的不同病毒小片段也覆蓋了78%～98%的病毒基因組，對于發(fā)現(xiàn)一些很難用傳統(tǒng)手段檢測的新病毒還是很有利的。這項高通量測序技術(shù)若應用于RNAi機制中產(chǎn)生的siRNAs的檢測，可用于病毒的發(fā)現(xiàn)。Scot t等[21]利用登革2型病毒同時感染蚊Aag2細胞和C6/36細胞株，并采用高通量測序技術(shù)對兩者產(chǎn)生的病毒小RNAs進行比較，發(fā)現(xiàn)Aag2內(nèi)的小RNA均是長dsRNA被Dicer裂解后的產(chǎn)物，而C6/36細胞株卻不能有效利用Dicer來裂解長的dsRNA，表明Aag2細胞宜于產(chǎn)生siRNA而C6/36細胞不能有效利用Dcr2這個RNAi途徑的關(guān)鍵起始因子來裂解長的dsRNAs。

Qingfa Wu等[22]闡述了蟲媒病毒感染宿主細胞后引發(fā)的RNAi機制，并同時介紹了siRNAs、miRNAs和piRNAs。他們利用FHV（f lock house virus）的B2缺失突變體感染果蠅S2細胞、用FHV感染轉(zhuǎn)基因線蟲以及用SINV（sindbis virus）感染成年蚊，對被感染的宿主中總的小RNA進行高通量測序以獲得病毒siRNAs，在多次的測序之后，通過對siRNAs序列進行比對和拼接，產(chǎn)生不同的重疊群，與病毒的全基因組進行比較，證明在果蠅、蚊和線蟲中產(chǎn)生的病毒siRNAs在序列上是重疊的，并可以用于病毒基因組的組裝。在這項研究中，研究人員描述了一種能通過無脊椎動物中病毒siRNAs的高通量測序和裝配來發(fā)現(xiàn)病毒的方法，而這些siRNAs是宿主對于感染的免疫應答過程中所產(chǎn)生的。

從RNAi現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)至今，已逐步闡明其結(jié)構(gòu)、功能及機制，并將其廣泛應用于基礎(chǔ)研究和應用研究中。在病毒檢測方面，可以將siRNAs視為病毒基因組的鏡像片段，通過高通量測序的方法獲得siRNAs并對siRNAs進行裝配和拼接，獲得病毒的全基因組片段，通過將高通量技術(shù)與RNAi相結(jié)合，可以直接對小RNA進行高通量測序，能夠快速檢測已知及發(fā)現(xiàn)未知蟲媒病毒。雖然人類對于RNAi的研究越來越深入，但是仍然存在許多未知的領(lǐng)域和許多沒有解決的關(guān)鍵性問題，例如在病毒檢測中還需明確不同種屬病毒對于RNAi反應的影響、siRNA的產(chǎn)生與病毒復制過程之間的關(guān)系、感染滴度與siRNA生成量的關(guān)系以及針對小片段哪種拼接算法最優(yōu)化等等；當然，小RNA的生成途徑、作用機制以及生物學功能仍需進一步明確。目前所發(fā)現(xiàn)的小RNA只是全部小RNA的冰山一角，而且許多已發(fā)現(xiàn)的小 RNA的功能還有待進一步探索。雖然面臨許多困難，但是在科學家們不斷地研究和探索中，RNAi技術(shù)終將被撕開一層層面紗，為人類所掌握并很好地應用于我們的生產(chǎn)生活當中，發(fā)揮更為重要的作用。

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（收稿：2013-08-21 修回：2013-09-02 編校：齊 彤）

Q 75

A

2095-3496（2013）04-0263-04

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