王顯紅 張博 尹時華

不同日齡乳鼠耳蝸外毛細胞底部Prestin蛋白的分布

王顯紅1張博1尹時華2

目的探討不同日齡乳鼠耳蝸外毛細胞（OHC）底部Prestin蛋白的分布。方法 分別取3、7、10日齡的Wistar乳鼠單離的耳蝸OHC，利用Prestin特異性抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察Prestin蛋白在單離OHC底部細胞膜上的表達與分布。結(jié)果 3天組乳鼠單離OHC底部細胞膜無Prestin蛋白的陽性染色；7天和10天組乳鼠的OHC底部細胞膜的中央部分可見Prestin蛋白的陽性染色。3、7、10天組中OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值分別為0.001±0.000、0.868±0.033、1.007±0.012，各時間點之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論不同日齡乳鼠OHC基底膜Prestin蛋白的分布存在差異，隨月齡增加，Prestin蛋白表達逐漸增強。

耳蝸； 外毛細胞； Prestin蛋白

Prestin作為外毛細胞的運動蛋白，是電運動和耳蝸放大效應的分子基礎(chǔ)。近年來關(guān)于Prestin蛋白在外毛細胞的表達、定位及其與外毛細胞電運動和耳蝸放大效應之間的關(guān)系成為研究的熱點。有研究［1～3］采用全基底膜免疫熒光染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Prestin主要分布在外毛細胞的側(cè)膜上，但有關(guān)外毛細胞基底部細胞膜是否有Prestin蛋白的表達尚存不同觀點。本研究以乳鼠為研究對象，旨在觀察不同日齡乳鼠單離外毛細胞基底部細胞膜Prestin蛋白的表達與分布。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及外毛細胞的分離 選擇出生3、7、10天的Wistar乳鼠，每組10只，雌雄不限，迅速斷頭并取出顳骨，打開聽泡置于PBS溶液中，在解剖顯微鏡下剝?nèi)ノ仛?，用游絲鑷剔除螺旋韌帶和螺旋神經(jīng)節(jié)組織后分離出含Corti器的基底膜，移除Reissner氏膜和Tectorial膜，置于濃度為0.25 mg／ml的木瓜蛋白酶中，37℃孵育10～12分鐘，輕柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液終止消化。懸液經(jīng)離心后去上清液，加入1 ml培養(yǎng)液在37℃、5%CO2孵箱孵育24 h。每組約能分離出毛細胞30～40個。

1.2 外毛細胞Prestin蛋白染色 經(jīng)24 h培養(yǎng)后的外毛細胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗5 min，3次。封閉液（10%山羊血清和1%BSA）封閉30 min，PBS浸洗5 min，3次。1：1 000羊抗Prestin多克隆抗體（Prestin Antibody（C-16）：Sc-22694，Santa Cruz）4℃過夜，室溫復溫10 min，PBS浸洗5 min，3次。1：64的FITC標記的兔抗羊IgG二抗抗體（BA1110，武漢博士得）在室溫下孵育一小時，PBS浸洗5 min，3次。封片后熒光顯微鏡下觀察。陽性染色為綠色熒光，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學方法 用Image-Proplus圖像分析軟件測定外毛細胞基底膜Prestin蛋白的光密度值，實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果 Prestin抗體標記的外毛細胞細胞側(cè)膜上均有較強的綠色熒光染色（圖1a～c）。3天組乳鼠OHC基底部細胞膜（圖1a紅色箭頭所指處）無Prestin蛋白陽性染色；7天和10天組乳鼠OHC基底部細胞膜的中央部分（圖b、c紅色箭頭所指處）可見Prestin蛋白的綠色熒光染色。2.2 OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值測量結(jié)果 3、7、10天組中OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值分別為0.001±0.000、0.868±0.033、1.007±0.012。經(jīng)統(tǒng)計學處理，3天組與7天和10天組OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；7天組與10天組OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

哺乳動物耳蝸具有頻率選擇性和放大效應，這一生理特征被認為與耳蝸OHC電運動有關(guān)。當外界聲音引發(fā)耳蝸內(nèi)液體波動及基底膜機械振動時，內(nèi)毛細胞和OHC表面的纖毛束可將這種機械刺激轉(zhuǎn)換為電信號，其中，內(nèi)毛細胞轉(zhuǎn)導并將聲音信息傳入大腦，OHC將電信號轉(zhuǎn)化為細胞長度的機械性改變，并反饋給基底膜，進一步增強基底膜的振動，通過正反饋作用使內(nèi)毛細胞感受的機械刺激被放大［4］。Prestin是一種特異性存在于耳蝸OHC的馬達蛋白，是OHC電運動和耳蝸放大效應的分子基礎(chǔ)，在耳蝸內(nèi)毛細胞未發(fā)現(xiàn)Prestin表達［1，2，5］。將小鼠的Prestin基因敲除之后，OHC無Prestin表達，胞體縮短，OHC變性，耳蝸敏感性降低［6～8］。

圖1 各組乳鼠OHC胞膜prestin蛋白染色圖

Belyantseva等［1］采用全基底膜免疫熒光染色的方法研究Prestin蛋白在OHC的定位和表達，用免疫熒光標記Prestin抗體，發(fā)現(xiàn)熒光集中在OHC側(cè)膜，而OHC纖毛、底部及胞質(zhì)等其他部位無熒光標記，提示Prestin蛋白分布在OHC的側(cè)膜上。但近年來有人運用熒光雙染及復合染色等方法觀察發(fā)現(xiàn)，成年大鼠單離OHC除了側(cè)膜有明顯的Prestin抗體陽性染色之外，在OHC底部的細胞膜上也有較強的陽性染色，同時在細胞核平面以下的側(cè)膜即側(cè)膜與基底部細胞膜結(jié)合處也有陽性染色［9］。

本實驗選用不同日齡乳鼠單離外毛細胞，利用Prestin特異性抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察Prestin在耳蝸OHC細胞膜上的表達與分布，結(jié)果顯示，3天組乳鼠單離OHC基底部細胞膜上無Prestin蛋白的陽性染色；7天和10天組乳鼠的OHC基底膜的中央部分觀察到了Prestin蛋白的陽性染色，且分布不斷增加，說明不同日齡乳鼠OHC基底膜上Prestin蛋白的分布存在差異。

與全基底膜免疫熒光染色顯示方法不同的是，本實驗采用的是單離耳蝸OHC，顯示除側(cè)膜外，在OHC基底部的細胞膜上也有陽性染色，其原因可能是，活體狀態(tài)下OHC坐于Deiters細胞上，OHC底部被神經(jīng)末梢與OHC之間的突觸所包繞，采用全基底膜免疫熒光染色時，OHC底部因被遮蔽而無法進行Prestin抗體染色［10］，從而出現(xiàn)不同的實驗結(jié)果。

曾有研究者提出［9，11］，Prestin蛋白的表達可被控制，并且在細胞生命周期中不斷更新，在OHC的底部可能存在Prestin蛋白庫，合成的Prestin蛋白由底膜向側(cè)膜擴散。從本實驗結(jié)果來看，這種推測值得商榷。

1 Belyantseva IA，Adler HJ，Curi R，et al.Expression and localization of prestin and the sugar transporter GLUT-5 during development of electromotility in cochlear outer hair cells［J］.J Neurosci，2000，20：116.

2 Zheng J，Long KB，Shen W，et al.Prestine topology：localization of protein epitopes in relation to the plasma membrane［J］. Neuroreport，2001，12：1 929.

3 Zheng J，Du GG，Matsuda K，et al.The C-terminus of prestin influences nonlinear capacitance and plasma membrane targeting［J］.J cell Sci，2005，118：2 987.

4 陳偉，楊仕明.Prestin-外毛細胞運動蛋白［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，42：394.

5 Zheng J，Shen W，He DZ，et al.Prestin is the moter protein of cochlear，outer hair cells［J］.Nature，2000，40：149.

6 Brownell WE，Spectre AA，Raphael RM，et al.Micro—and nanomechanics of the cochiear outer hair cell［J］.Annu Rev Biomde Eng，2001，3：169.

7 Liberman MC，Gao J，He Dz，et al.Prestin is required for electromotility of the outer hair cell and for the cochlear amplifier［J］.Nature，2002，419：300.

8 郭運凱，謝鼎華，楊新明.Prestin基因敲除小鼠聽力和毛細胞改變的相關(guān)性研究［J］.中華耳科學雜志，2004，2：245.

9 于寧，翟所強，趙紅波.外毛細胞基底側(cè)膜動力蛋白分布均一性的研究［J］.聽力學及言語疾病雜志，2009，17：461.

10 Adler HJ，Belyantseva IA，Merritt RC Jr，et al.Expression of prestin，amembrane motor protein，in the mammalian auditory and vestibular periphery［J］.Hear Res，2003，184：27.

11 Yu N，Zhu ML，Zhao HB.Long—term usage of salicylate upregulates prestin expression in the guinea pig cochlea［J］.Cell Mo1 Life Sci，2008，65：407.

（2013-03-06收稿）

（本文編輯 雷培香）

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.024

時間：2013-7-3 16：57

R339.16

A

1006-7299（2013）04-0407-02

1 湖北科技學院耳鼻咽喉教研室（咸寧 437100）； 2 廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130703.1657.012.html