呂成林 杜秋霞 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫(yī)局 272400） 鄭麗艷（山東省嘉祥縣科技局）

豬附紅細(xì)胞體三種染色方法的比較

呂成林 杜秋霞 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫(yī)局 272400） 鄭麗艷*（山東省嘉祥縣科技局）

分別利用姬姆薩氏、瑞氏、吖啶橙3種方法對(duì)豬附紅細(xì)胞體進(jìn)行染色，結(jié)果表明：3種染色法大多數(shù)可見(jiàn)星紅細(xì)胞體，吖淀橙染色可在90%以上出現(xiàn)星紅細(xì)胞的樣本中檢出附紅細(xì)胞體。

附紅細(xì)胞體 姬姆薩氏 瑞氏 吖啶橙 染色

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生于紅細(xì)胞表面、血漿、骨髓等部位引起的一種人畜共患病。該病在臨床上以高熱、貧血、黃疸為主要特征，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康，并呈范圍擴(kuò)大趨勢(shì)，該病已引起人們的廣泛關(guān)注。本文對(duì)豬附紅細(xì)胞體的3種診斷方法進(jìn)行了比較，以期為臨床實(shí)踐診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬附紅細(xì)胞體待檢血液

采自自然發(fā)病的附紅細(xì)胞體患豬的靜脈血，并用健康豬的靜脈血做陰性對(duì)照。其中的陰性對(duì)照是用瑞氏、姬姆薩氏、吖啶橙染色后為陰性的健康豬的血液。

1.2 姬姆薩氏染色

1.2.1 姬姆薩氏染色液的配制 按文獻(xiàn)(曹澎輝，1991)進(jìn)行。取姬姆薩染料0.6g，加入50ml甘油內(nèi)，于56℃下加熱2h，然后加入甲醇50ml，于3～5d后過(guò)濾，即為原液。使用時(shí)與各種pH的PBS液以1∶20的比例混合，即為染色液。

1.2.2 染色方法 無(wú)菌采取豬靜脈血，與染色液1∶1混合。推片、干燥后用甲醇固定，待甲醇揮發(fā)干凈后將玻片浸于不同pH的染色缸中，每種pH值放4張，并分別于6、12、18、24h后進(jìn)行觀察。

1.3 瑞氏染色

1.3.1 染色液的配制 按常規(guī)配制。

1.3.2 染色方法 推片自然干燥后，滴加染色液，染色3min，然后加等量蒸餾水再染5min，蒸餾水沖洗。

1.4 吖啶橙染色

1.4.1 吖啶橙染色液的配制 按文獻(xiàn)(任怡敏，1996)進(jìn)行。將0.01g吖啶橙溶于100ml Tris-HCl(0.05mol/l，pH7.5)緩沖液中。

1.4.2 染色方法 將涂有標(biāo)本的玻片用甲醇固定，待甲醇揮發(fā)干凈后將玻片置濕盒內(nèi)，加適量吖啶橙染液，37℃，100min。用pH7.4的PBS輕輕沖洗兩次，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 姬姆薩染色

2.1.1 不同pH值染色液對(duì)染色效果的影響 在pH 8.0以上的堿性環(huán)境中，姬姆薩染料對(duì)附紅細(xì)胞體的著色效果較好，附紅細(xì)胞體著色較深，比較清晰，而在pH8.0以下的環(huán)境中則著色不好。見(jiàn)表1。

表1 不同pH值染色液染色效果

2.1.2 染色時(shí)間的影響 染色6或12h觀察，整個(gè)血片著色不好，18h以上可獲得滿意效果，鏡下觀察附紅體著色深，輪廓分明。姬姆薩氏染色后在紅細(xì)胞表面上可見(jiàn)到0.5-1.5μm的藍(lán)紫顆粒，呈圓形、逗號(hào)狀，每個(gè)紅細(xì)胞上可出現(xiàn)多個(gè)。

2.2 瑞氏染色

瑞氏染色后細(xì)胞較大，紅細(xì)胞和附紅細(xì)胞體均為深藍(lán)紫色，附紅細(xì)胞體著色較深。在星形紅細(xì)胞的突出部位或紅細(xì)胞表面，可見(jiàn)到圓形深染的顆粒狀物，每個(gè)紅細(xì)胞上有3-8個(gè)不等。

2.3 吖啶橙染色

在熒光顯微鏡下紅細(xì)胞為暗淡的綠色，附紅細(xì)胞體為發(fā)明亮熒光的綠色小體。

在大多數(shù)紅細(xì)胞邊緣及表面上可看到一些明亮的小體，直徑1μm 左右，為被吖啶橙染色的附紅細(xì)胞體。

2.4 不同染色方法比較

臨診出現(xiàn)發(fā)燒、貧血、皮紅、紫紺等癥狀的病豬血液推片，大多數(shù)可見(jiàn)星形紅細(xì)胞，吖啶橙染色可在90%以上的出現(xiàn)星形紅細(xì)胞的樣本中檢出附紅細(xì)胞體。見(jiàn)表2。

表2 不同染色方法比較

3 討論

目前，臨床獸醫(yī)往往根據(jù)臨床癥狀、病理變化或顯微鏡下有無(wú)變形的紅細(xì)胞作為附紅細(xì)胞體的診斷依據(jù)，有些學(xué)者由于不能直接看到附紅細(xì)胞體的存在，不承認(rèn)附紅細(xì)胞體的致病作用(王水周, 2004; 張家靜, 2003)。本研究結(jié)果表明，使用正確的染色方法，可在大多數(shù)自然發(fā)病的病例中看到附紅細(xì)胞體，在嚴(yán)重病例中，絕大多數(shù)紅細(xì)胞上都可以看到附紅細(xì)胞體，而且數(shù)量越多，看到紅細(xì)胞體越多，細(xì)胞變形越明顯。三種染色方法都可以使附紅細(xì)胞體著色，但是各有優(yōu)缺點(diǎn)。

姬姆薩氏染色的優(yōu)點(diǎn)是著色效果較好，缺點(diǎn)是染色所需時(shí)間較長(zhǎng)。另外需要注意pH的影響，pH值偏堿有利于附紅體的著色。附紅細(xì)胞體的顏色與染液的pH值有密切關(guān)系，pH值愈高則染色愈深。這是因?yàn)榧匪_氏染液由天青及伊紅組成，天青游離時(shí)帶正電荷，伊紅游離時(shí)帶負(fù)電荷，被染物的主要成分為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)本身帶兩種電荷，當(dāng)在堿性液體中時(shí)增加，天青離子附著得多些，附紅細(xì)胞體則較藍(lán)。在稀釋姬姆薩氏原液時(shí)如果使用蒸餾水(通常偏酸)，不利于區(qū)別紅細(xì)胞和附紅細(xì)胞體，這可能是其他作者看不到附紅細(xì)胞體一個(gè)原因。染色時(shí)間對(duì)附紅細(xì)胞體的著色也很重要，浸染18h以上才能獲得滿意的效果。

瑞氏染色的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速，但是瑞氏染液中常常出現(xiàn)一些顆粒影響觀察。配制染料時(shí)要研磨仔細(xì)，先倒入少量染料、少量甲醇及甲醇后繼續(xù)研磨，如此反復(fù)數(shù)次。配制好后要多次過(guò)濾，使用時(shí)盡量使用中間層，以防顆粒沉積于血涂片上，影響觀察效果。染色后如果標(biāo)本片上附有較多顆粒，可滴加少量染液，稍后沖洗即可除去。

附紅細(xì)胞體在急性階段，吖啶橙染色后熒光顯微鏡下呈淺至深橘黃色。在慢性病例中呈淡黃色至淡綠色的點(diǎn)狀。本研究中吖啶橙染片后附紅細(xì)胞體呈亮綠色。另外，用吖啶橙染色時(shí)核仁和核碎片也可發(fā)出熒光，因此，血涂片應(yīng)在采樣的當(dāng)天制作，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性。

很多作者認(rèn)為附紅細(xì)胞體不是引起病畜死亡的主要原因，主要原因是紅細(xì)胞破損引起機(jī)體免疫功能下降，從而引起繼發(fā)癥導(dǎo)致機(jī)體死亡。但本研究表明紅細(xì)胞上有如此多的附紅體，機(jī)體必然要對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，最后導(dǎo)致紅細(xì)胞嚴(yán)重變形、大量裂解，而導(dǎo)致黃疸、溶血性貧血、死亡。

[1] 曹澎輝. 獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M]. 北京∶ 農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 1991.

[2] 任怡敏, 白嵐, 梁玉等. 應(yīng)用吖啶橙染色快速檢測(cè)沙眼衣原體[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志, 1996, 19(2)∶ 124.

[3] 王水周, 睢春霞. 對(duì)近幾年部分豬附紅細(xì)胞體病診斷報(bào)道的一些看法[J]. 養(yǎng)禽業(yè), 2004(2)∶ 30.

[4] 張家靜, 劉小燕, 李召展等. 對(duì)豬發(fā)生附紅細(xì)胞體病的調(diào)查研究和討論[J]. 河南畜牧獸醫(yī), 2003, 24(1)∶ 26-29.

[5] Zachary J E,Besgall EJ. Erythrocyte membrance alterations associatedwith the attachment and cation of Eperythrozoon suis∶ A light and electronmicroscopic study[J]. Vet Pathol, 1995, 22∶ 164.

S852.16+4

A

1007-1733(2013)06-0004-02

2013–04–01）

*通訊作者