李 斌李會榮劉學(xué)江楊智國常維山

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 271018 ②山東省飼料質(zhì)量檢驗所）

試驗研究

豬鏈球菌II型高免卵黃抗體粉的研制

李 斌①②李會榮②劉學(xué)江②楊智國②常維山①*

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 271018 ②山東省飼料質(zhì)量檢驗所）

試驗用豬鏈球菌II型CVCC606株制備疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，首免后7d檢測到低水平的卵黃抗體，再經(jīng)3次強化免疫，于末次免疫后7d卵黃抗體效價達到9log2，最高效價達到10log2，高水平卵黃抗體可維持到末次免疫后50d，隨后出現(xiàn)下降。收集抗體效價大于9log2的高免蛋卵黃，經(jīng)噴霧干燥成卵黃抗體粉，效價在10log2以上，卵黃抗體粉質(zhì)量穩(wěn)定，于室溫(25℃)保存6個月抗體水平無明顯降低。體外抑菌試驗表明，高免卵黃抗體粉可有效抑制豬鏈球菌II型CVCC606株和豬鏈球菌II型強毒分離株。高免卵黃抗體粉可有效預(yù)防豬鏈球菌II型菌株對BALB/c小鼠的致死性感染。

鏈球菌 卵黃抗體 免疫

豬鏈球菌是致豬鏈球菌病的主要病原，可引起豬腦膜炎、敗血癥及關(guān)節(jié)炎等疫病，人通過特定的傳播途徑亦可感染。目前豬鏈球菌已鑒定出35個血清型(1至34型及1/2型)，其中血清II型是引起人、豬感染的主要致病菌，在我國，1998年江蘇豬群發(fā)生了豬鏈球菌病，隨后發(fā)生人感染死亡報道，分離菌為豬鏈球菌II型；2005年四川省暴發(fā)人、豬感染豬鏈球菌II型疫情。近年來，豬鏈球菌II型感染在我國豬群的發(fā)病率日漸增高，其可單獨治病，也常常和其他病原混合感染，致發(fā)病豬高熱或死亡，造成了很大損失。

對于豬鏈球菌II型感染的預(yù)防，目前國內(nèi)主要采用滅活疫苗，但其使用效果存在差異，且抗體保護時間短，需多次免疫才能獲得較強的免疫力。主要用敏感的抗生素治療，但隨著抗生素的大量應(yīng)用，耐藥性日趨嚴重，治療效果不佳。卵黃抗體在預(yù)防和治療動物疾病方面具有特異性強、作用迅速、無殘留等優(yōu)點，得到了廣泛應(yīng)用。筆者嘗試進行豬鏈球菌II型高免卵黃抗體粉的研制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 BALB/c小鼠，15～20g，購自山東大學(xué)實驗動物中心；160日齡羅曼商品代蛋雞，山東濟南某雞場。

1.2 菌株 豬鏈球菌2型CVCC606株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬鏈球菌2型強毒分離株，分離自山東東營某豬場患敗血癥死亡豬，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院鑒定。

1.3 血清 豬鏈球菌2型陽性雞血清，自制的豬鏈球菌II型抗原高免雞采血分離而成；陰性雞血清，未經(jīng)豬鏈球菌II型抗原免疫的健康雞血清。

1.4 培養(yǎng)基、試劑及噴霧干燥設(shè)備 普通瓊脂平板，血瓊脂平板，血清肉湯(含5%牛血清、0.5%葡萄糖)，10號白油，硬脂酸鋁，吐溫-80、司盤-80，甲醛，醋酸，醋酸鈉。LPG-25型噴霧干燥機，購自常州市東南干燥設(shè)備有限公司。

1.5 凝集試驗用抗原的制備 豬鏈球菌2型CVCC606株接種血瓊脂平板培養(yǎng)過夜，同樣方法復(fù)壯傳代3次，挑取生長旺盛的典型菌落3～4個接種于血清肉湯培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)17～24h；加甲醛至終濃度為0.3%，37℃滅活24h，其間震蕩搖勻5～6次；6000rpm離心分離沉淀菌體，用PBS (0.01mol，pH7.20懸浮沉淀菌體，再離心洗滌2次，用PBS懸浮至菌濃度為2×109的菌液。作為凝集試驗用抗原。

1.6 免疫抗原的制備 同前凝集試驗用抗原的制備方法，用PBS(0.01mol，pH7.2)懸浮至菌濃度為1×109的菌液，作為免疫抗原制備用抗原液。按照王明俊[1]介紹的方法，將94%的10號白油和6%的司盤-80混合后，加硬脂酸鋁加熱溶解，121℃滅菌為油相?？乖杭尤霚缇耐聹?80為水相。按油相水相2∶1比例，少量油相攪拌的同時，緩慢加入水相和剩余的油相，并高速攪拌至形成穩(wěn)定的油包水型疫苗，即為免疫用抗原。進行無菌檢驗，合格后4℃冷藏備用。

1.7 蛋雞的免疫 160日齡羅曼商品代蛋雞300只，用免疫抗原進行免疫，首免劑量為1ml，然后每隔14d進行強化免疫，共強化免疫3次，劑量分別為1.5、2、2.5ml，采用頸部皮下、胸部或腿部肌肉多點注射的方式，每點注射劑量不超過0.6ml。同時設(shè)不免疫對照雞30只。

1.8 免疫雞蛋抗體水平檢測 于首次免疫后每隔7d，隨機取免疫組雞蛋20枚，進行抗體水平檢測。卵黃抗體分離提取處理方式如下：分離卵黃，混合、攪拌均勻為卵黃液；配制0.02mol/L醋酸鹽緩沖液(pH4.5)；量取蛋黃液和醋酸鹽緩沖液，按蛋黃液緩沖液1∶3的比例混合，充分搖勻；加入3%的辛酸，搖勻后靜置過夜；分取上清液，用濾紙過濾，收集濾液，進行卵黃抗體效價測定。同時取未免疫對照組雞蛋同法處理，進行抗體效價測定。

采用平板凝集試驗改良進行抗體效價測定[2]。在玻板的網(wǎng)格中每格中央加入滅菌PBS 50μl，然后吸取經(jīng)處理的卵黃抗體樣品50μl加入第一格中，用移液器頭充分混勻后，吸取混合液50μl加于第二格中，充分混勻，依次進行倍比稀釋至第8格(即稀釋1024倍)，吸出50μl棄去。第9、10格和第11格分別作為抗原對照和陽性、陰性血清對照。然后向每格的液滴上加入檢測用抗原50μl，用牙簽攪勻。2～5min后觀察玻板每格的凝集反應(yīng)現(xiàn)象，陰性血清對照格輕度均勻渾濁(抗原被2倍稀釋的狀態(tài))，判定為陰性，標為“－”，陽性對照格出現(xiàn)絮狀塊，判定為陽性，標為“＋”。出現(xiàn)的凝塊越多，液體越透明，則表明陽性反應(yīng)越強，由弱到強分別標為“+”“++”“+++”“#”。出項“++”以上凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為該份血清的效價(卵黃抗體在提取過程中已經(jīng)進行了2log2的稀釋）。

1.9 高免卵黃抗體粉的制備及效價測定 當(dāng)所測蛋黃中抗體水平達9log2以上時收取雞蛋。用新潔爾滅對雞蛋進行表面消毒，打破雞蛋，蛋液經(jīng)攪拌后加人2倍體積的生理鹽水?dāng)嚢杌靹?，用噴霧干燥機進行噴霧干燥，進風(fēng)溫度140℃、出風(fēng)溫度控制在72℃，噴霧干燥成粉。推算單位體積卵黃液生產(chǎn)卵黃抗體粉的質(zhì)量，在加工后，按比例取一定量的卵黃抗體粉溶于注射用水中，處理后進行抗體效價測定。

1.10 卵黃抗體粉質(zhì)量分析及存放穩(wěn)定性試驗 取3批次卵黃抗體粉樣品進行所含水分測定。卵黃抗體粉密封分裝于鋁箔袋中，在25℃恒溫箱中放置，每隔1個月取樣，樣品按1.9所述方法進行抗體效價測定，考察抗體粉的穩(wěn)定性。

1.11 卵黃抗體粉體外抑菌試驗 豬鏈球菌2型CVCC606株和強毒分離株分別于血清肉湯中培養(yǎng)至菌濃度達到1×105CFU/ml，每株菌培養(yǎng)物分裝3個無菌試管中，每試管5ml；卵黃抗體粉加入適量水?dāng)噭颍崛?，再?jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，無菌操作取部分濾液用滅菌生理鹽水進行1∶2、1∶4兩個稀釋度稀釋備用。于每株菌的三個試管中分別加入不同稀釋度卵黃抗體粉提取過濾溶液1ml。37℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1、2、3h取樣0.1ml，涂布于血瓊脂平板上進行菌落計數(shù)。

1.12 卵黃抗體粉對小鼠的被動保護試驗 （1）豬鏈球菌II型CVCC606株和豬鏈球菌2型強毒分離株對小鼠的LD50的測定。將55只BALB/c小鼠隨機分成11組，每組5只，第11組作為對照組，腹腔注射無菌生理鹽水0.2ml，將兩株鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)物分別用無菌生理鹽水稀釋至菌濃度為3×108、3×107、3×106、3×105、3×104cfu/ml五個稀釋度，每組小鼠腹腔注射不同稀釋度的菌液0.2ml，接種后觀察并記錄每組小鼠的發(fā)病、死亡情況，試驗時間為7d，按Reed-Muench法計算2個菌株的LD50。（2）卵黃抗體粉對小鼠的被動保護試驗。40只BALB/c小鼠隨機分成4組，每組10只，1、3組每天取用7倍生理鹽水稀釋并混勻的卵黃抗體粉溶液0.2ml滴口1次，連用3d，第2、4組用0.2ml生理鹽水滴口作為對照組，第4天1、2組和3、4組分別用5LD50的豬鏈球菌II型CVCC606株和強毒分離株腹腔注射攻毒，判斷卵黃抗體粉對小鼠的保護率。

2 結(jié)果與分析

試驗制備的免疫抗原為油包水型礦物油佐劑疫苗，為乳白色；檢驗無雜菌生長。

2.1 蛋雞免疫后抗體水平監(jiān)測 免疫雞的卵黃中抗體變化如下圖，首次免疫后7d開始檢測到特異性抗體，抗體效價于第4次免疫后7d達到9log2，末次免疫后50d抗體水平仍然維持在9log2以上，抗體水平在第56天降至8log2以下。

圖 蛋雞免疫后抗體水平變化情況

2.2 噴霧干燥對卵黃抗體效價的影響 噴霧干燥后的卵黃抗體粉略有蛋香味，色澤略顯黃色，質(zhì)地均勻，粒度大約在40目左右。不同批次卵黃抗體在噴霧干燥前后的抗體效價見表1(噴霧干燥后得到的卵黃抗體粉重量約為干燥前卵黃液的46%，因此，按此比例加入注射用水稀釋后同卵黃液的方法進行抗體水平測定)。

表1 噴霧干燥前后卵黃抗體效價變化情況 (log2)

2.3 卵黃抗體粉水分含量 3批次卵黃抗體水分含量分別為3.4%、3.8%、3.3%，有利于產(chǎn)品的保存。

2.4 卵黃抗體粉貯藏穩(wěn)定性試驗 卵黃抗體粉密封保存于鋁箔袋中，放置25℃恒溫箱中，每月取樣測定效價。結(jié)果見表2。

表2 卵黃抗體粉抗體效價變化情況 (log2)

2.5 卵黃抗體粉的體外抑菌試驗 2株菌培養(yǎng)至菌濃度為1×105所用時間約為4h。當(dāng)高免卵黃抗體粉提取液效價達到7log2時，對豬鏈球菌2型CVCC606株和強毒分離株均有抑殺作用；稀釋1倍后(1∶2稀釋)，仍能抑殺CVCC606株，但不能完全抑殺強毒分離株；1∶4稀釋，對兩株細菌的抑殺效果均很差。同批未經(jīng)免疫的對照組雞卵黃抗體粉液則無抑菌活性。抑菌試驗結(jié)果見表3。

表3 不同培養(yǎng)時間(h)培養(yǎng)液中菌含量 (cfu/ml)

2.6 卵黃抗體粉對小鼠的保護試驗 （1）不同菌株對BALB/c小鼠LD50的測定。兩株菌高劑量組(3×108CFU/ml)小鼠于攻毒后約6h開始出現(xiàn)死亡，2d內(nèi)全部死亡，而低劑量組(3×104CFU/ml)部分小鼠則出現(xiàn)一過性癥狀后，在7d觀察期內(nèi)，全部存活。試驗計算得豬鏈球菌II型CVCC 606株和強毒分離株對BALB/c小鼠的LD50分別為3.1×107CFU和1.1×107CFU，因此，卵黃抗體粉保護試驗用的攻毒菌量(5倍LD50)分別為1.05×108CFU(豬鏈球菌II型CVCC 606株)和5.5×107CFU(豬鏈球菌II型強毒分離株)。（2）卵黃抗體粉對小鼠的被動保護試驗。卵黃抗體粉對小鼠的被動保護試驗結(jié)果見表4。服用對照組雞卵黃抗體的小鼠于攻毒后均表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀：擠堆、反應(yīng)遲鈍、呼吸緊促等，第1組于攻毒后4h開始出現(xiàn)死亡，1d內(nèi)全部死亡，第3組則在9h內(nèi)全部死亡。服用免疫組卵黃抗體粉的第4組小鼠于攻毒后第2天死亡2只，其余全部存活，保護率為90%，而第2組小鼠全部存活，保護率為100%。

表4 卵黃抗體粉對BALB/c小鼠的被動保護試驗結(jié)果

3 討論

（1）用豬鏈球菌2型CVCC606株制成油乳劑滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，首免后7d可以檢測到蛋黃中特異性的卵黃抗體，強化免疫3次后，蛋黃中抗體水平于末次免疫后7d達到9log2，高水平卵黃抗體維持約50d，此后開始慢慢下降，故將再次免疫的周期定位50d。（2）卵黃抗體具有較高的穩(wěn)定性，對酸、堿和熱均有一定的抵抗力。卵黃抗體在雞蛋中可以較長時間保持活性，但在較高溫度時，雞蛋容易變質(zhì)，致使卵黃抗體也不能長時間貯存?？紤]到高溫對抗體活性的影響，選擇了較溫和的噴霧干燥的工藝，在較低的進風(fēng)(140℃)、出風(fēng)溫度(72℃)條件下，抗體效價在噴霧干燥前后基本沒有變化，有效的保證了抗體的活性。貯存試驗表明，在常溫條件下，抗體可以保存6個月以上。（3）體外抑菌試驗表明，制備的豬鏈球菌血清II型卵黃抗體粉對豬鏈球菌血清II型菌株具有良好的抑殺作用，卵黃抗體對對應(yīng)的制備免疫用抗原的菌株的抑殺效果更為明顯，于較低濃度就可以完全殺滅細菌，對強毒分離株，也表現(xiàn)出較強的殺滅作用，但稍差于前者。BALB/c小鼠被動保護試驗也表明卵黃抗體粉對不同菌株感染的保護存在差異。因此，用自家苗做抗原制備卵黃抗體粉來預(yù)防本場豬鏈球菌II型感染效果更好。（4）研究表明，新生仔豬腸道可吸收異種蛋白[3]。近年來國內(nèi)外學(xué)者開展了很多利用卵黃抗體防治豬傳染病的研究。Yokoyama等[4]將提純的ETEC的K88、K99、987P制成單價菌毛蛋白苗，免疫蛋雞獲得卵黃抗體粉末，EIISA檢測結(jié)果表明，抗K88、K99、987P的卵黃抗體能夠特異性地與相應(yīng)的菌毛抗原作用。用卵黃抗體對不同ETEC菌株攻毒的新生仔豬進行口服治療，治療組仔豬全部存活，而對照組仔豬死亡率超過80%。高云英等[5]用ETEC的K88、K99、987P標準菌株和地方分離菌株制成多價菌體卵黃抗體經(jīng)預(yù)防、攻毒試驗及臨床治療效果觀察，對新生仔豬免疫保護率可達90%以上，3日齡仔豬攻毒保護率達98%以上，3～11日齡仔豬臨床治愈率達95%以上。李學(xué)伍等[6]的試驗結(jié)果表明，應(yīng)用多種血清型大腸桿菌制備多價大腸桿菌疫苗免疫蛋雞，從而制備出的卵黃抗體對腹瀉仔豬的治愈率蛋雞，從而制備出的卵黃抗體對腹瀉仔豬的治愈率最高可達97.7%。本研究為口服卵黃抗體預(yù)防豬鏈球菌病奠定了基礎(chǔ)。

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1007-1733(2013)06-0001-04

2013–04–15）

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