劉瀠蔚，田見暉，龐云渭，郭 敏，楊美玲，張 倩，王曉紅，安 磊*，張林波

(1.吉林農業(yè)大學 生命科學學院生物制藥創(chuàng)新實驗室，吉林 長春 130118;2.中國農業(yè)大學 動物科學技術學院/農業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193)

豬精子不同處理方式對其IVF的影響

劉瀠蔚1，2，田見暉2，龐云渭2，郭 敏2，楊美玲2，張 倩2，王曉紅2，安 磊2*，張林波1*

(1.吉林農業(yè)大學 生命科學學院生物制藥創(chuàng)新實驗室，吉林 長春 130118;2.中國農業(yè)大學 動物科學技術學院/農業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193)

豬體外受精(in vitro fertilization，IVF)技術效率的不穩(wěn)定性限制了該技術在畜牧生產中的應用。本研究比較了精子獲能前后的狀態(tài)和活精子數(shù)之間的關系;精子獲能后的濃度和狀態(tài)對IVF后胚胎卵裂率、囊胚率的影響;不同個體來源的精子混合后對IVF卵裂率、囊胚率的影響。結果表明:精子獲能前后，活精子數(shù)無顯著性差異(P＞0.05);檢測精子的濃度與狀態(tài)與卵裂率、囊胚率無直接關聯(lián);利用混合精子進行IVF，單一精子所得到的IVF囊胚率分別是A 17.00%、B 12.24%、C 33.00%、D 4.81%、E 10.00%、F 22.00%，混合精子的囊胚率分別是A+B 77.00%、C+D 67.01%、E+F 35.50%，混合精子和單一精子的囊胚率差異不顯著。

豬;體外受精;精子;獲能

安磊，男，講師。E－mail:anleim@yahoo.com.cn

長期以來，豬的體外受精(IVF)一直存在技術效率低、穩(wěn)定性差的問題，具體表現(xiàn)為多精入卵率高、雄原核形成率低、IVF后胚胎發(fā)育率低等［1］。相關研究報道表明，精子的質量和處理方式等因素對豬的IVF效率存在顯著影響。Piotr Miciński的研究結果表明，精子形態(tài)和活力并不能有效地反映其受精能力［2］。而精子在獲能前的濃度與狀態(tài)能否反映精子獲能后的相關指標，以及精子的受精能力還有待確定。

諸多研究表明，不同個體、不同批次的精子，各項指標及受精能力差異很大［3～8］，這也是導致IVF體系不穩(wěn)定的重要因素之一。因此，通過對不同來源的精子進行混合，可能會減少或彌補個體及批次間差異對IVF效率造成的不利影響。同時，觀察混合后精子活力、數(shù)目等指標能否得到改善，以及囊胚率是否有所提高。

本實驗比較了精子在獲能前后的狀態(tài)和密度，研究了獲能后精子的狀態(tài)對IVF卵裂率和囊胚率的影響。同時，研究了不同個體來源的精子混合對IVF胚胎發(fā)育效率的影響，為豬IVF效率的改進提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 卵巢和卵母細胞的采集

豬的卵巢取自北京周邊屠宰場。將離體卵巢立即放入裝有預熱的加有雙抗的38.5℃生理鹽水的保溫瓶中，2 h內運至實驗室。

1.2 豬的精液

豬的精液來源于北京中順景盛種豬改良有限公司。

1.3 實驗用主要試劑

TCM－199購自美國Gibco公司;其余藥品均購自美國Sigma－Aldrich公司。

基礎成熟培養(yǎng)液為TCM－199。新購的M199(500 mL)需加青霉素G 0.0325 g，鏈霉素0.025 g，溶好后過濾。添加的10%卵泡液，添加終濃度為0.1 mg/mL的L－半胱氨酸和終濃度為10 ng/mL的表皮生長因子。

操作液TL:65.0 mol青霉素、50 mg/mL鏈霉素、114.00 mol NaCl、3.20 mol KCl、2.00 mol NaHCO3、2.00 mol CaCl2·2H2O、0.34 mol KH2PO4、0.50 mol MgCl2·6H2O、10.00 mol HEPES、10.00 mol乳酸鈉、0.20 mol丙酮酸鈉、12.00 mol D－山梨醇、0.3%BSA，pH=7.2。

受精液為改良Tris緩沖液(mTBM)，成分為:113.1 mol NaCl、3.0 mol KCl、7.5 mol CaCl2·2H2O、20.0 mol Tris、11.0 mol葡萄糖、5.0 mol丙酮酸鈉、2 mol咖啡因、0.2%BSA，pH=7.6～7.8。

胚胎培養(yǎng)液PZM－3:108.00 mol NaCl、10.00 mol KCl、0.35 mol KH2PO4、0.40 mol MgSO4·7H2O、25.07 mol NaHCO3、0.20 mol丙酮酸鈉、2.00 mol Ca－(lactate)2·5H2O、1.00 mol L－谷氨酰胺、5.00 mol?；撬?、20.00 mol BME、10.00 mol MEM、0.065 mol青霉素G、0.050 mol鏈霉素、4.00 mol BSA，pH=7.2～7.4。以上所有試劑都用0.22μm濾器過濾。

1.4 豬卵母細胞體外成熟

豬卵巢用含有雙抗的生理鹽水清洗兩次后轉入38.5℃的水浴鍋中。用20 mL注射器選擇2～6 mm的卵泡抽取卵丘卵母細胞復合體(COCs)，用TL清洗兩次，在鏡下挑取包裹有3層以上的COCs。

將挑選的COCs在覆蓋有石蠟油預先平衡好的TCM－199微滴中洗3次，轉入覆蓋有石蠟油預先平衡好的TCM－199培養(yǎng)微滴中(100μL)，每滴100個卵母細胞，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)條件是5%CO2的空氣，38.5℃及100%相對飽和濕度。

1.5 豬精液的處理

取出3 mL精液，在處理前先取出100μL，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，并在顯微鏡下觀察精子的活力 (活率)，游動狀態(tài)，是否斷尾及死精的多少，并記錄統(tǒng)計。吸取2 mL精液先用TL清洗并離心兩次，再用mTBM清洗離心一次，然后在5%CO2的空氣，38.5℃及100%相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中獲能40 min。取上浮的精子300μL在顯微鏡下計數(shù)，觀察狀態(tài)并進行實驗。

1.6 卵母細胞的體外受精

將成熟好的COCs脫除顆粒細胞，挑取排出第1極體的卵母細胞。用mTBM做受精液，每滴50μL，每滴放入15～20個，然后向每個受精滴放入50μL受精獲能后的精液，單一精液組共分為6組，分別命名為A、B、C、D、E、F，混合組分別分為A+B、C+D、E+F。放入5%CO2，38.5℃及100%相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中受精6 h，受精結束后轉入覆蓋有石蠟油預先平衡好的PZM－3微滴(70μL)中洗掉精子，再換入覆蓋有石蠟油的預先平衡好的PZM－3培養(yǎng)微滴中進行培養(yǎng)，每滴70μL，30個卵母細胞。培養(yǎng)2 d后觀察卵裂率，7 d觀察囊胚率。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結果用平均數(shù)±標準差表示(Mean±SD)，利用SPSS中One Way－ANOVA過程對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 獲能前后精子數(shù)目、狀態(tài)的比較

精子在獲能前后均用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，并在顯微鏡下觀察精子的活力 (活率)、游動狀態(tài)的情況，以及是否斷尾及死精的比例(圖1)。

圖1 不同種公豬獲能前后精子數(shù)的比較

結果表明，精子在獲能前后其活精子數(shù)、死精子數(shù)無必然聯(lián)系，數(shù)據(jù)差異不顯著(P＞0.05)。同時，觀察發(fā)現(xiàn)精子的狀態(tài)在獲能前后也不存在關聯(lián)性。同一精子在獲能前畸形多，精子存在凝集現(xiàn)象，但是獲能后直線運動的精子所占比例很高，且畸形精子率很低;反之，獲能前精子活力很好，直線運動精子數(shù)很多，但在獲能后卻有相當一部分“轉圈運動”，甚至出現(xiàn)畸形精子。

2.2 精子的數(shù)目、狀態(tài)對卵裂率和囊胚率影響

用不同個體的精子進行體外受精，記錄卵裂率與囊胚率。與相對應的精子狀態(tài)、數(shù)目進行比較分析(圖2)。

圖2 獲能后上浮精子數(shù)和IVF所得卵裂率、囊胚率比較

結果表明，不同批號，不同批次精子的數(shù)目相差很大，而相對應精子所做IVF所得到的卵裂率和囊胚率與精子的數(shù)目無關(P＞0.05)。結果顯示，受精前包括活率、密度等指標在內的精子狀態(tài)與受精后胚胎發(fā)育效率之間并不存在明顯趨勢性關聯(lián)。因此，精子的狀態(tài)并不是理想的預測其受精能力的指標。例如，并不是直線運動多的、畸形率低的精子，囊胚率與卵裂率就一定高。

2.3 精子混合與單一個體精子進行IVF，卵裂率和囊胚率的對比

不同個體的精子進行混合，與混合前的精子，分別進行IVF，觀察卵裂率及囊胚率(圖3)。

圖3 單獨精液和混合精液IVF結果比較

結果表明，混合精子的IVF的卵裂率分別是A+B:77.00%、C+D:67.01%、E+F:35.50%，囊胚率分別是 A+B:28.50%、C+D:22.84%、E+F:3.00%，單一個體精子所得到的IVF卵裂率分別是A:76.00%、B:61.22%、C:82.00%、D:22.12%、E:34.00%、F:53.00%囊胚率分別是 A:17.00%、B:12.24%、C:33.00%、D:4.81%、E:10.00%、F:22.00%。由此可見，利用單一個體的精子，與不同個體來源精子混合后的IVF卵裂率及囊胚率沒有顯著關聯(lián)。

3 討論

本實驗中，獲能前的精子數(shù)量和狀態(tài)對獲能后的精子數(shù)量和狀態(tài)沒有顯著影響，獲能后的精子數(shù)量和狀態(tài)也不能決定IVF的囊胚率和卵裂率的高低。通過混合不同個體來源的精子并不能達到穩(wěn)定IVF胚胎發(fā)育效率的目的。有研究表明，最佳受精的精子終濃度為10×106［8］。從以上結果可以發(fā)現(xiàn)，精子數(shù)量在這個范圍內才能進行IVF是不完全可信的。本實驗的精子數(shù)量有個別沒有達到要求，但是所得囊胚率卻也并不低于其他組。精子數(shù)量過高，會導致IVF過程中粘附在卵母細胞表面的死精過多而影響配子的發(fā)育，有可能會導致囊胚率降低。當然，過多的精子也會導致多精入卵。但是多精入卵也不完全是由獲能后精子的數(shù)量的多少決定，精子穿透透明帶的能力也是一個重要的原因。

雖然在本實驗中獲能后精子狀態(tài)與IVF胚胎發(fā)育效率并無顯著的相關，但較好的精子狀態(tài)仍然是保證豬IVF效率的重要指標，這種精子必須能夠進行頂體反應，頂體反應是精子受精能力的重要先決條件［8，9］。本研究中所用獲能后精子狀態(tài)有一些運動方式為轉圈運動，并且觀察的視野范圍內有很多畸形精子。但我們統(tǒng)計囊胚率發(fā)現(xiàn)沒有必然影響。分析原因，很有可能是因為這些精子中部分精子仍具有較強的受精能力，并且能夠進行高效的頂體反應。這也說明精子濃度不一定需要達到10×106才能夠完成受精，具體的原因和內在機理需要進一步的研究。

混合精子后，我們預期的想法是活力強的精子帶動活力較差的精子加強上浮能力，更有利于篩選質量高的精子，完成頂體反應達到受精的同時，穩(wěn)定囊胚率。但是，不同個體來源精子混合后所得的囊胚率與單一個體精子的囊胚率相比沒有顯著性差異。下一步的研究，需要對其囊胚的質量、細胞總數(shù)以及凋亡細胞數(shù)進行觀察與分析。

豬的IVF技術不僅是家畜體外胚胎技術體系中極其重要的環(huán)節(jié)，同時為受精機理和干細胞研究等提供了重要的研究材料。對于豬的干細胞而言，被認為在人類疾病及藥物篩選模型、組織修復與替換中都具有極強的應用潛力。但是目前真正的豬胚胎干細胞仍未建成［10～12］，而豬 IVF效率低下被認為是主要制約因素之一［13］。所以，提高和穩(wěn)定豬IVF對未來豬的胚胎干細胞等實驗的開展有著至關重要的作用。

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S828.3

A

1005－2739(2013)03－0016－04

2013－03－01

劉瀠蔚(1987－)，女，吉林省人，在讀碩士。E－mail:tongtong722@yahoo．cn

張林波，男，教授，碩士生導師，研究方向為免疫生物工程。E－mail:cczlb@126.com