朱紅霞,李良娟,胡林峰

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

一株活性細菌的抑菌活性研究

朱紅霞,李良娟,胡林峰

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

以實驗中發(fā)現(xiàn)的一株細菌（ZXK）為材料,通過搖瓶發(fā)酵的方法獲得其發(fā)酵液,采用對峙培養(yǎng)法和生長速率法分別測定了菌體和發(fā)酵液對棉花黃萎病菌Verticillium dahliae,小麥赤霉病菌病菌Gibberella zeae,水稻紋枯病菌Thanatephorus cucumeris,蘋果炭疽病菌Glomerella cingulata,小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis,番茄灰霉病菌Botrytis cinerea,辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici等7種植物病原真菌的生物活性.結果表明：ZXK菌體及其發(fā)酵液對7種病原菌都有較好的抑制作用,ZXK發(fā)酵液能夠完全抑制蘋果炭疽病菌、水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和小麥紋枯病菌菌絲的生長,對棉花黃萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制率也達到了90%以上；發(fā)酵液經(jīng)離心、過濾和高壓蒸汽滅菌處理后仍具有生物活性,其中以高壓蒸汽滅菌處理的發(fā)酵液樣品的抑菌活性損失最大.

ZXK菌株；培養(yǎng)；發(fā)酵；抑菌活性

隨著化學農藥使用量的增大及使用范圍的擴張,特別是高毒、高殘留農藥的持續(xù)使用,農藥對環(huán)境的負面影響日趨嚴重.社會的進步和現(xiàn)代的發(fā)展要求開發(fā)出新的能夠保護農產品穩(wěn)產高產,又不影響農產品質量,不影響環(huán)境和其他生物安全的農藥產品.針對化學農藥日漸顯現(xiàn)的種種弊病,農藥研究人員發(fā)現(xiàn)從生物中尋找防治有害生物的生物農藥最有可能達到選擇性強、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對人畜無害的理想要求[1].有效地利用微生物間的拮抗作用及其代謝產物的有效活性成分制備生物農藥進行生物防治將是一個必要的發(fā)展方向.

微生物是生物殺菌劑的重要來源,微生物殺菌劑主要有農用抗生素、細菌殺菌劑、真菌殺菌劑等類型,并且具備選擇性高、安全性好、易降解、用量少、殘留少、污染小等優(yōu)點[2-3].據(jù)統(tǒng)計,目前國際上生物農藥產品已超過100多種,但90%以上是微生物殺蟲劑.而Philip在2002年就預測第二個重要的商業(yè)化的生物農藥將是微生物殺菌劑[4].

在我國農業(yè)生產從傳統(tǒng)方式向綠色產業(yè)和出口創(chuàng)匯產業(yè)的過渡中,微生物農藥具有重要的意義.由于細菌的種類多、數(shù)量大、繁殖速度快,可以通過功能基因的修飾、改造、轉移等基因工程手段構建新型的工程菌,且易于人工培養(yǎng)和控制.因此,細菌殺菌劑的研究和開發(fā)具有較大的前景[5-6].

本試驗中使用的ZXK菌株為從抑菌活性測定試驗受污染平板中分離得到,試驗過程中發(fā)現(xiàn)該菌能夠明顯抑制供試植物病原真菌的擴展生長.為進一步探索ZXK菌株的抑菌活性,對ZXK菌體及其發(fā)酵液的抑菌活性進行了研究,為其在農業(yè)殺菌劑領域的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 ZXK菌種ZXK菌種轉接在PDA試管斜面培養(yǎng)基中,于4℃冰箱中保存.

1.1.2 供試植物病原菌選取7種植物病原真菌,分別是：棉花黃萎病菌Verticillium dahliae,小麥赤霉病菌病菌Gibberella zeae,水稻紋枯病菌Thanatephorus cucumeris,蘋果炭疽病菌Glomerella cingulata,小麥紋枯病菌Rhizoctonia cereali,番茄灰霉病菌Botrytis cinerea,辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici.所有供試菌種均由河南科技學院化學化工學院生測室提供,菌種用PDA斜面培養(yǎng)基保存在4℃下備用.

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g,葡萄糖12 g,瓊脂粉12 g,水1 000 mL,pH自然.將馬鈴薯去皮,切成塊煮沸20 min,然后用紗布過濾,補足水至1 000 mL,再加葡萄糖及瓊脂,完全溶化后分裝,121℃高壓蒸汽滅菌20 min.

PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g,葡萄糖12 g,水1 000 mL,pH自然.將馬鈴薯去皮,切成塊煮沸20 min,然后用紗布過濾,補足水至1 000 mL,再加葡萄糖,完全溶化后三角瓶分裝,每瓶100 mL,121℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.2 試驗方法

1.2.1 ZXK菌種的發(fā)酵菌種的發(fā)酵培養(yǎng)采用搖瓶發(fā)酵法,用接種環(huán)挑取ZXK菌種轉接于盛有100 mL PD培養(yǎng)液的三角瓶中,置于搖床中28℃培養(yǎng)36 h.

1.2.2 發(fā)酵液的處理采用離心、濾芯及高壓滅菌等3種方法對ZXK發(fā)酵液進行處理.

離心處理：3 000 r/min離心5 min,取上清液；

濾芯處理：孔徑為0.45 μm的濾芯過濾取濾液；高壓滅菌處理：121℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.2.3 抑菌活性測定分別采用平板對峙法和生長速度法測定ZXK菌種及其發(fā)酵液的抑菌活性.

平板對峙法：將細菌ZXK及7種供試病原真菌置于PDA固體培養(yǎng)基平板上生長5 d,用滅菌的打孔器在各長滿菌絲的平板上打制直徑為4 mm的菌餅備用.分別挑取已制好的ZXK菌餅及供試病原真菌菌餅各1塊,接于PDA平板中央兩側,相距約為3 cm.將各平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5 d后開始觀察長勢.

生長速率法：用移液槍移取發(fā)酵液1 mL加入20 mL的刻度試管中（以加入等量無菌水作為對照）,用融化的PDA培養(yǎng)基定容至10 mL,混勻后倒入直徑為9 cm的已滅菌培養(yǎng)皿中制成帶藥平板,設置空白對照.用接種針挑取ZXK菌餅（4 mm）倒扣在平板中央,每皿放置1個菌餅,每個處理重復3次.處理好的培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)間里培養(yǎng)72 h后開始檢查結果（水稻紋枯病菌48 h后開始檢查結果）[7].按以下公式計算菌落生長直徑及抑制率：

菌落生長直徑/mm＝菌落直徑-4

抑制率/%=（（對照組菌落生長直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落生長直徑）×100

2 結果與分析

2.1 ZXK菌體抑菌活性的測定

ZXK對7種供試植物病原真菌的抑菌作用結果（平板對峙法）見圖1.

圖1 ZXK對7種植物病原菌的對峙抑菌作用Fig.1 Dual culture of ZXK on seven phytopathogens

由圖1可知,在平板對峙培養(yǎng)試驗中,ZXK對7種供試植物病原真菌均表現(xiàn)出了抑菌作用,說明ZXK菌株在生長過程中能夠分泌抑菌活性物質.

2.2 ZXK發(fā)酵液抑菌活性的測定

發(fā)酵液對7種病原真菌的抑制作用（生長速率法）見表1.

由表1可知,在生長速率法中,ZXK發(fā)酵液對7種供試病原菌均具有很強的抑菌活性.其中,對蘋果炭疽病菌、水稻紋枯病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌和棉花黃萎病菌等6種病原菌的抑菌活性都在90%以上,甚至能夠完全抑制蘋果炭疽病菌、水稻紋枯病菌、小麥紋枯病菌和小麥赤霉病菌菌絲的生長.

表1 ZXK發(fā)酵液對7種病原菌的抑菌活性Tab.1 Antifungal activities of ZXK fermentation broth on seven phytopathogens

2.3 處理方法對ZXK發(fā)酵液抑菌活性的影響

為明確ZXK發(fā)酵液抑菌活性成分的性質,進一步選取小麥赤霉病菌病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌和辣椒疫霉病菌等4個不同亞門的病原菌作為供試對象,分別測試離心、濾芯過濾和高壓蒸汽滅菌3種處理方法對ZXK發(fā)酵液活性的影響,結果見表2.

表2 ZXK發(fā)酵液經(jīng)不同方法處理后的抑菌活性Tab.2 Antifungal activities of ZXK fermentation broth treated with different methods%

由表2可知,經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理的發(fā)酵液對4種病原真菌的抑制率均大幅降低,其抑菌活性顯著低于離心和濾芯過濾處理的抑菌活性,說明ZXK發(fā)酵液中的抑菌活性物質具有熱不穩(wěn)定性.經(jīng)離心和濾芯過濾處理所得ZXK發(fā)酵液對小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌和水稻紋枯病菌的抑菌活性均有所降低,其中以對小麥紋枯病菌的抑菌活性降低較為明顯,降低到50%以下,而對水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌的抑制率仍高于90%.值得關注的是,離心和濾芯過濾處理所得ZXK發(fā)酵液對辣椒疫霉病菌的抑制率高于未處理ZXK發(fā)酵液,由49.20%升到75%以上,這可能是由于活性物質在高溫高壓處理下轉變?yōu)閷苯芬呙共【哂刑禺惿锘钚缘奈镔|.

3 小結

本試驗對ZXK菌及其發(fā)酵液的生物活性進行了初步研究,結果表明ZXK菌體及其發(fā)酵液對供試的7種植物病原真菌均具有較強的抑菌活性；ZXK發(fā)酵液的處理方法對其活性有顯著影響.因此,對ZXK菌株進行鑒定,對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,獲取最佳發(fā)酵條件,對于擴大培養(yǎng)ZXK菌具有重要意義.同時,明確ZXK發(fā)酵液中抑菌活性成分的性質,采用活性追蹤的方法對發(fā)酵液中的抑菌活性成分進行分離,進而鑒定其結構,可以為開發(fā)、應用ZXK菌株,發(fā)展微生物農用殺菌劑提供一定的理論依據(jù).

[1]沈寅初.農用微生物殺菌劑研究進展[J].國外醫(yī)藥：抗生素分冊,1998,19（2）：155-160.

[2]紀明山,谷祖敏,張楊.生物農藥研究與應用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].沈陽農業(yè)大學學報,2006,37（4）：545-550.

[3]沈寅初,張一賓.生物農藥[M].北京：化學工業(yè)出版社,2000.

[4]Jarvis P,關愛瑩,劉長令.生物農藥的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].農藥科學與管理,2002,23（3）：29-31.

[5]李勇楊,李銘剛,文孟良.微生物農藥的研究和應用進展[J].貴州農業(yè)科學,2003,31（2）：62-63.

[6]王春,汪琨,崔志峰.芽孢桿菌活體微生物農藥研究現(xiàn)狀及應用[J].浙江農業(yè)科學,2013（7）：830-834.

[7]陳年春.農藥生物測定技術[M].北京：北京農業(yè)大學出版社,1991.

（責任編輯：鄧天福）

Study on antifungal activity of an active bacteria

Zhu Hongxia,Li Liangjuan,Hu Linfeng
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

An active bacteria was found in the experimental process（ZXK）.Shake flask fermentation method was applied to obtain fermentation broth.The antifungal activities of ZXK and its fermentation broth were detected against Verticilliumdahliae,Gibberella zeae,Thanatephoruscucumeris,Glomerella cingulata,Rhizoctonia cerealis,Botrytis cinerea and Phytophthora capsici by dual culture method and growth rate method separately.The results showed that the ZXK and its fermentation broth had antifungal activities against tested fungi.The ZXK fermentation broth could inhibit the growth of G.zeae,T.cucumeris,G.cingulata and R.cerealis absolutely,and the inhibition rates on V. dahliae and B.cinerea were higher than 90%.ZXK fermentation broth had antifungal activity after treated by centrifuging,filtering and autoclaves.The autoclaves treating decreased the antifungal activity of fermentation broth greatly.

ZXK bacteria；cultivate；fermentation；antifungal activity

S482.2+92

A

1008-7516（2013）06-0021-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2013.06.006

2013-09-18

大學生課外科技活動創(chuàng)新基金（20111045）

朱紅霞（1982-）,女,山西汾陽人,助理實驗師.主要從事天然的殺菌劑研究.

胡林峰（1981-）,男,湖北天門人,博士,副教授.主要從事天然源殺菌活性物質篩選及其應用研究.