李 鵬

（沈陽市蘇家屯中興街道中興社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，遼寧 沈陽110102）

精氨酸酯酶的分離和純化

李 鵬

（沈陽市蘇家屯中興街道中興社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，遼寧 沈陽110102）

蝮蛇蛇毒中活性的組合是激肽釋放酶，類凝血酶及類活血纖維酶。其中類凝血酶的精氨酸酯酶的活力最高。分析表明含有較多的酸性氨基酸及輔氨酸。蝮蛇中的類凝血酶屬胰蛋白酶家族，通過切除血纖維蛋白原的凝聚，起凝血作用，但在體內(nèi)因它不會激活凝血因子XⅢ，所以由其水解產(chǎn)生的纖維蛋白凝塊的側(cè)鏈不能交聯(lián)，易被纖維蛋白溶酯降解，導(dǎo)致體內(nèi)纖維蛋白濃度下降而表現(xiàn)出抗凝效應(yīng)。

精氨酸酯酶 Arvin；(Ancrod)；Reptilase；crotalase

蝮亞科蛇毒中含有多種蛋白質(zhì)，具有多種多樣的生理和毒理，非酶類雜蛋白[1]，因而精氨酸酯酶的提純工藝一直很困難，臨床應(yīng)用很大程度地受限。本實驗的是經(jīng)過粗提及純化等工藝，盡量除去副作用較大的毒素的干擾，篩選出相對簡便、有效的方法，將精氨酸酯酶分離提純，最大限度減少毒性，提高療效。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

藥品和試劑：長白山蝮蛇蛇毒、DEAE-SephadexA-50 SWEDEN PHARMACIA產(chǎn)品、TAME（中科院上海生物化學(xué)研究所）、牛血清白蛋白（中科院上海生物物理所生化）。

1.2 儀器

WFZ800-D2型紫外一可見分光光度計、T22型光柵分光光度計、BS-100A自動部分收集器、LG-3型多用泳凍干燥機(jī)、DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 酶活力測定[2]

以TAME為底物，比較不同含量待測酶液條件下，在500nm處測光密度值并記錄。見表1。

2.2 蛋白含量測定

Follin-酚法[4]標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白稀釋不同濃度后于660nm處測比色值并記錄。見表2。

表1 酶活力測定

表2 蛋白含量測定

2.3 神經(jīng)毒測定[5]

稀釋至0.5μ，取0.4mL加入10.0mL蛋白底物（蛋黃一只，加1mol/L Nacl溶液20mL，0.01mol/L Cacl2溶液20mL，脫氧膽酸鈉溶液20mL，用0.02mol/L NaOH調(diào)pH，用水稀釋至200mL，混勻使pH為8.0，置37℃保溫備用）中，置恒溫水浴（37℃±2℃）并立即準(zhǔn)確計時，于4min內(nèi)緩緩加入NaOH（0.02mol/L）0.3mL，反應(yīng)至4min時，迅速測反應(yīng)pH值（參考精制抗栓酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）。

2.4 出血毒測定[6]

將活力稀釋至1μ，取0.2mL在小白鼠（18g左右）背部通過皮下注射方式給藥，24h后，將小白鼠處死，去皮，觀察背部皮上出血斑情。

2.5 精氨酸酯酶的粗提

DEAE-SephadexA-50柱層析[7]。

2.5.1 柱層析分離條件

二乙氨基乙基葡聚糖A-50酸堿處理并用0.01mol/L Tris-Hcl緩沖液平衡后，裝柱（40cm×lcm）。稱取一定量長白山蝮蛇蛇毒溶于0.01mol/L Tris-Hcl緩沖液中，在0.1%EDTA中透析，低溫下離心（500轉(zhuǎn)/分），15min取上清液上樣。洗脫先用Tris-Hcl （0.0lmol/L）洗至無峰，再用Nacl直線濃度梯度洗脫（攪拌瓶：300mL Tris-Hclaq，貯存瓶：300mL含0.5mol/L Nacl的Tris-Hclaq）洗脫流速4mL/15分，洗脫液在紫外儀器280nm處測光密度結(jié)果。

2.5.2 活性測定結(jié)果

見表3。

表3 活性測定結(jié)果

經(jīng)過DEAE-Sephgadex A-50柱層析，可將具有精氨酸酯酶的峰和具有高神經(jīng)毒出血毒的峰得到初步分離，但其中精氨酸酯酶保持活力的峰Ⅳ，可能還含有一定濃度的神經(jīng)毒和出血毒，還需要進(jìn)步進(jìn)行純化分離。

通過以上分離方法重復(fù)操作，獲得三批測量值相近的樣品，將其中分離得到的峰Ⅳ（精氨酸酯酶活力峰）冷凍干燥待用。

2.6 精氨酸酯酶的純化過程

按設(shè)計的兩條路線分別進(jìn)行路線—：1.DEAE—Sephadex A—50柱層析[8]，①柱層析條件：將以上得到的一部分干品溶于0.01mol/L Tris-HCL緩沖液中，透析除鹽準(zhǔn)備上樣，酸堿處理過的DEAESepddex A-50平衡后上柱（30cm×lcm），用鹽濃度梯度洗脫（濃度0.1～0.4mol/L）洗脫體積為200mL，速度4mL/30min，洗脫液280nm處比色。②酶活力測定，見表4。

表4 酶活力測定

以此結(jié)果可說明路線一用來純化精氨酸酯酶可行。

路線二：1.Sephadex G—100柱層析，①柱層析條件：用酸堿處理G-100后用Tris-HCL緩沖液平衡，裝柱（30cm×lcm），精提中精氨酸酯酶活力峰凍干品溶于Tris-HCL緩沖液中，蒸餾水透析除鹽后上柱，用0.15mol/L NacI（Tris-HCL）溶液洗脫，洗脫速度為4mL/30min，于280nm處測光密度。②酶活力測定結(jié)果，見表5。

表5 酶活力測定

粗提產(chǎn)品經(jīng)G-100分離后，發(fā)現(xiàn)活性較之前有所集中，可神經(jīng)毒和出血毒還有部分未除去，需要進(jìn)一步分離、純化。

2.DEAE-SephadexA-50柱層析，①柱層析分離條件：將1中I峰凍干品于Tris-HCL中，處理后的DEAE-SephadexA-50裝柱（30cm× lcm），樣品透析除鹽后上柱，洗脫用0.15mol/L Nacl（Tris-HCL），洗脫速度為4mL/30min，洗脫下來樣于280nm處測光密度。②酶活力測定結(jié)果，見表6。

表6 酶活力測定

由1、2兩步分離結(jié)果證明：路線二工藝較路線一工藝比較能達(dá)到把精氨酸酯酶中神經(jīng)毒、出血毒除去，最終達(dá)到純化目的。

2.7 酶純度鑒定

聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳[8][參考精制抗栓酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（藥廠提供）]：a.藥廠提供精制栓酶產(chǎn)品（0.5μ）；b.路線一產(chǎn)品；c.路線二產(chǎn)品。

3 結(jié)果與討論

3.1 應(yīng)用二乙氨基乙基葡聚糖A-50和鹽濃度梯度洗脫的方法，能有效地長白山白嵋蝮蛇蛇毒有效部分粗分，得到至少10個實用蛋白峰。

3.2 將粗分中得到的具有高精氨酸酯酶活力、低出血毒、低神經(jīng)毒部分再按兩條路線分離。

路線—：DEAE-Sephadex A-50；路線二：Sephadex-G-100→DEAE-Sephadex A-50。實驗結(jié)果表明兩條路線對于純化精氨酸酯酶均可行。

3.3 上部分離得到實用產(chǎn)品可通過電泳初步鑒定為四條帶，與目前精制抗栓酶產(chǎn)品圖譜相近，略有不同，主要不同在各種成分含量上。

3.4 路線一和路線二的產(chǎn)品相比，二產(chǎn)品的區(qū)帶較一產(chǎn)品的區(qū)帶更清晰，可能因為經(jīng)過Sephadex-G-100分離后，峰活力被濃縮，位置集中，有利于第二次DEAE-Sephadex-A-50分離，這樣看來，路線二略優(yōu)于路線一，但由于實驗條件所限，收率未準(zhǔn)確計算，路線一有一步損失而路線二有兩步損失，哪一個更可行，有待于進(jìn)一步探討。

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R282.710.2

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：1671-8194（2013）05-0078-03