張鈦，劉義

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

糖尿病心血管病變是糖尿病對(duì)人最主要的危害，近年來(lái)在社會(huì)和醫(yī)藥界日益受到廣泛關(guān)注。眼底等小血管糖尿病病變?cè)缫咽艿街匾?，肢體血管、冠脈、腦血管等大、中血管并發(fā)癥已成糖尿病重要慢性并發(fā)癥之一，目前受到高度重視。隨著對(duì)糖尿病研究的深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要的作用。通過(guò)藥物調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，可阻止或延緩并發(fā)癥發(fā)生。

邱麗穎等［1－2］報(bào)道阿司匹林在大鼠腦缺血再灌注損傷時(shí)，通過(guò)提高Bcl－2 并降低Bax 基因蛋白表達(dá)，提高Bcl－2/Bax 比值而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。有研究報(bào)道阿司匹林發(fā)揮保護(hù)作用的有效劑量包括相當(dāng)人常規(guī)使用的小劑量(日用100 mg)，而目前臨床糖尿病患者大多因合并或并發(fā)心腦血管疾病而長(zhǎng)期服用小劑量阿司匹林，但糖尿病患者長(zhǎng)期服用小劑量阿司匹林對(duì)主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡是否有影響?是否有主動(dòng)脈保護(hù)作用?目前臨床觀察研究已有多篇報(bào)道［3－6］，尚缺乏較深入的實(shí)驗(yàn)研究。我們采用大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素造成I型糖尿病動(dòng)物模型，研究小劑量阿司匹林對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈顯微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為小劑量阿司匹林可能會(huì)發(fā)揮保護(hù)糖尿病患者主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡及病理?yè)p傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠30 只，體重180～220 g，遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥物、試劑和器械 (1)拜阿司匹靈(阿司匹林腸溶片)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司進(jìn)口分裝，生產(chǎn)批號(hào):BJ00557;(2)鏈脲佐菌素(STZ)，美國(guó)sigma 公司產(chǎn)品; (3)兔抗大鼠Bcl－2 抗體、Bax 單克隆抗體、二步法非免疫血清、生物素二抗及辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素試劑盒(PV6001)、DAB 顯色試劑盒由中山杉生物技術(shù)公司提供，Caspase－3 單克隆抗體、生物素化二抗試劑盒(SP0023)美國(guó)sigma 購(gòu)自北京博奧森公司產(chǎn)品; (4)DP72 型OLYMPUS 光學(xué)成像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;(5)京都II 型血糖檢測(cè)儀，日本ARKRAY，Inc 株式會(huì)社產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與處理 30 只雄性SD 大鼠，隨機(jī)選取8 只作為正常對(duì)照組，22 只尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg;1 g STZ 溶于100 mL 檸檬酸鹽緩沖液配制而成，pH4.5)，正常對(duì)照組大鼠注射同等體積的緩沖液。3 天后，禁食12 h，剪大鼠尾尖部，采用血糖儀現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定血糖濃度，將血糖測(cè)定結(jié)果大于16.7 mmol/L 視為1 型糖尿病造模成功。隨機(jī)選取造模成功大鼠16 只，分為糖尿病模型組和9 mg/kg 阿司匹林 (ASA 組)治療組(按體表面積換算相當(dāng)人日用100 mg)，每組8 只。ASA 組大鼠，拜阿司匹林片研碎后加適量蒸餾水，混勻后以0.1 mL/100 g 灌胃給藥12 w，正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠同日灌服等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠禁食12 h，5% 水合氯醛腹腔麻醉，打開(kāi)腹腔，迅速取出主動(dòng)脈，以冰鹽水沖洗，切取主動(dòng)脈組織放入10% 中性甲醛內(nèi)，24 h 后石蠟包埋。

1.4 血液指標(biāo)檢測(cè) 用血糖儀及專用血糖試紙現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)大鼠血糖。

1.5 HE 染色和免疫組化染色 石蠟包埋組織經(jīng)5 μm 系列切片后，常規(guī)行HE 染色后病理學(xué)觀察。

免疫組織化學(xué)染色:將組織石蠟包埋塊常規(guī)切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)抗原(將切片置于含pH 6.0 枸椽酸緩沖液的高壓鍋內(nèi)，加熱至減壓閥噴氣2 min，自然冷卻，取出，0.01 M PBS 洗滌3次，每次5 min);3% 過(guò)氧化氫溶液處理10～30 min 以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 M PBS 洗滌3次，每次5 min;滴加1:100 稀釋的滴加第一抗體(bcl－2、bax)，4 ℃過(guò)夜，0.1 M PBS 洗5 min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔 IgG 多聚體(PV6001)，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌3次，每次5 min;滴加生物素化第二抗體，37 ℃20 min，0.1 M PBS 洗5 min×3 次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素工作液，37 ℃20 min，0.1 M PBS洗5 min ×3 次;使用DAB 顯色試劑盒1 mL 蒸餾水加顯色劑A、B、C 各1 滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色6 min，充分水洗;蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸酒精分化、1% 胺水反藍(lán)、充分水洗、經(jīng)70%乙醇5 min、尿80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2 次、95%乙醇5 min 2 次、100%乙醇5 min 2 次，脫水、二甲苯透明5 min 2 次、中性樹(shù)脂封片。Caspase3 檢測(cè):一抗洗滌后，滴加生物素化羊抗兔IgG (SP0023)，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌3 次，每次5 min;滴加試劑SP，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌3 次，每次5 min;DAB 顯色。其余步驟同上。結(jié)果觀察:用Olympus 成像分析系統(tǒng)高倍鏡(×400)下觀察和采集顯微圖像，采用美國(guó)顯微鏡圖像分析測(cè)量軟件Image－Pro Plus 6.0 測(cè)量平均累積光密度值(mean－IOD)，以黃色為陽(yáng)性表達(dá)，分析Caspase－3、Bcl－2 和Bax 的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 小劑量阿司匹林對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈顯微結(jié)構(gòu)的影響(圖1) 圖1 可見(jiàn)，糖尿病模型組大鼠主動(dòng)脈顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理改變，血管壁肌間纖維排列紊亂，扭曲明顯;小劑量ASA 治療組出現(xiàn)上述病理改變明顯減輕，表明小劑量ASA 對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈顯微結(jié)構(gòu)病理改變有保護(hù)作用。

2.2 小劑量阿司匹林對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(圖2 和表1) 表1 和圖2 可見(jiàn)，正常對(duì)照組，主動(dòng)脈平滑肌Caspase－3 和Bax呈弱表達(dá)，Bcl－2 表達(dá)較明顯;糖尿病模型組，主動(dòng)脈平滑肌Caspase－3 和Bax 表達(dá)均明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組，而B(niǎo)cl－2 表達(dá)弱于正常對(duì)照組，Bcl－2/Bax 比值同時(shí)明顯低于正常對(duì)照組;小劑量ASA 治療組，主動(dòng)脈平滑肌Caspase－3 和Bax 表達(dá)均明顯弱于糖尿病模型組，而B(niǎo)cl－2 表達(dá)明顯強(qiáng)于糖尿病模型組和正常對(duì)照組，Bcl－2/Bax 比值同時(shí)明顯高于糖尿病模型組。

表1 小劑量阿司匹林(ASA)對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(平均累積光密度值)的影響(，n=8)

3 討 論

凋亡過(guò)程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接地關(guān)系，在主動(dòng)脈疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中同樣發(fā)揮著作用。近年來(lái)的大量研究表明，細(xì)胞凋亡受多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，這些基因包括Bcl－2家族、Bax 家族、Caspase 家族、癌基因如C－myc、抑癌基因P53等。細(xì)胞凋亡的過(guò)程大致可分為幾個(gè)階段:在接受凋亡信號(hào)后凋亡調(diào)控蛋白間發(fā)生相互作用，促使蛋白水解酶的活化(Caspase)，引起細(xì)胞膜、線粒體和染色體結(jié)構(gòu)改變等一系列連續(xù)反應(yīng)過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl－2 和Bax 蛋白就是一對(duì)重要的凋亡調(diào)控蛋白，它們分別與細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)，Bcl－2/Bax 比值被許多學(xué)者作為評(píng)價(jià)凋亡調(diào)控的重要指標(biāo)［7］。盡管直接判定凋亡細(xì)胞的指標(biāo)則包括流式細(xì)胞檢查、Tunal 染色、凋亡小體及染色體檢查等，但蛋白水解酶(Caspase)的表達(dá)增強(qiáng)也可以作為啟動(dòng)凋亡的重要標(biāo)志。

我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠主動(dòng)脈Caspase－3和Bax 表達(dá)均明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組，而B(niǎo)cl－2 表達(dá)弱于正常對(duì)照組，Bcl－2/Bax 比值同時(shí)明顯低于正常對(duì)照組，這表明主動(dòng)脈凋亡能力增強(qiáng)，凋亡啟動(dòng)信號(hào)強(qiáng)烈。小劑量ASA 治療組，糖尿病大鼠主動(dòng)脈Caspase－3 和Bax 表達(dá)均被對(duì)抗，尤其是Bcl－2 表達(dá)明顯增強(qiáng)，甚至明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組，大幅提高Bcl－2/Bax 比值。這表明，小劑量阿司匹林可通過(guò)提高Bcl－2/Bax 比值，尤其是提高Bcl－2 表達(dá)，抑制糖尿病大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡過(guò)程。我們發(fā)現(xiàn)小劑量阿司匹林抑制糖尿病大鼠主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡的同時(shí)，主動(dòng)脈血管壁肌間纖維排列紊亂和扭曲等病理改變明顯減輕，但其意義尚不清楚。

阿司匹林對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)缺氧/缺糖損傷已有多篇研究報(bào)道，其中抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是重要保護(hù)機(jī)制［8－10］。謝寶明等［11］采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位技術(shù)發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對(duì)缺氧/缺糖的神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位具有一定的穩(wěn)定作用，并認(rèn)為是抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

除凋亡機(jī)制外，目前已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出阿司匹林對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈的影響與調(diào)節(jié)COX－2 表達(dá)、炎癥因子等因素有關(guān)［12－13］。

圖1 大鼠主動(dòng)脈HE 染色(×400)

圖2 大鼠主動(dòng)脈免疫組織化學(xué)染色Caspase－3、Bax 和Bcl－2 (×400)

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