劉丹平，趙輝，齊鑫

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院;2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

內(nèi)皮祖細(xì)胞 (Endothelial Progenitor Cells，EPCs)是一類來源于骨髓，存在于外周血中循環(huán)中，并且可以在生長因子的作用下可分化為內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的前體細(xì)胞，也被稱為血管母細(xì)胞。它和造血細(xì)胞來源于同一前體細(xì)胞，這一前體細(xì)胞被稱為造血干/祖細(xì)胞［1］。EPCs 多持續(xù)存在于骨髓、外周血、臍帶血和胎兒肝臟中，其中又以骨髓和臍帶血中含量最高且增殖能力最強(qiáng)，因此常常作為獲得EPCs 的重要來源［2］。本實(shí)驗(yàn)通過密度梯度離心聯(lián)合差速貼壁法獲取EPCs，并進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1 w 齡幼兔(遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)、10%胎牛血清(Hyclone)、DMEM 培養(yǎng)液(Sigma)、M199 培養(yǎng)液(Hyclone)、EGF (英國PeproTech)、血管內(nèi)皮生長因子VEGF (英國Pepro-Tech)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF (英國Pepro-Tech)、淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?、胰蛋白酶(Hyclone)、FITC 標(biāo)記的荊豆凝集素(美國Sigma)、DiI 標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(美國Vector)、人纖維連接蛋白(美國Chemicon)、羊抗兔CD34 抗體、羊抗兔CD133 抗體、羊抗兔VEGFR－2/KDR 抗體、FITC 標(biāo)記的羊抗IgG (美國SantaCruz)等。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的分離 取1 w 的兔四肢長骨，直接用PBS 沖出骨髓，將沖出的骨髓液收集在帶刻度的離心管中，800 rpm×5 min，可見分3 層，上層為脂肪等雜質(zhì)，中層為PBS，下層沉淀為骨髓及血細(xì)胞。留取下層沉淀，加入4 mL 培養(yǎng)基，用吹打管混勻，在帶刻度離心管中加入4 mL 淋巴細(xì)胞分離液，用滴管取混勻后的骨髓液，沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000 rpm×20 min。離心后管內(nèi)液體分為3 層，上層為血漿和PBS 液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)為主的白色絮狀狹窄層。用槍頭插到絮狀層，吸取MNCs。用PBS 洗滌2 次(1000 rpm 離心5 min)，棄上清，DMEM 完全培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶里，在37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 BMSC 向EPCs 的誘導(dǎo)培養(yǎng) 原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后首次換液，獲取未貼壁的細(xì)胞，1000 rpm 離心10 min，然后重懸在M199 培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清，10 μg/LVEGF、2 μg/LbFGF、10 μg/LEGF)。接種在預(yù)先包被有人纖維連接蛋白(HFN)的培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2的濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d 后首次換液，去除其中不貼壁細(xì)胞，以后每隔3～4 天換液1 次。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%時(shí)可傳第1 代，以后每8～10 天可傳1 代。

1.2.3 骨髓來源的EPCs 鑒定 (1)細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下，每日觀察細(xì)胞生長情況和形態(tài)學(xué)變化;(2)流式細(xì)胞檢測 取消化培養(yǎng)的P3 代細(xì)胞，離心后去上清液，PBS 稀釋并計(jì)數(shù);將細(xì)胞懸液以每管1 ×105個(gè)細(xì)胞，分裝于各個(gè)流式管，預(yù)先設(shè)定空白對照管、單純二抗管及CD133、CD34、VEGFR－2 各1 管;用PBS 洗滌后離心2 次，完全去血清后，加入300 μL 的PBS，加1 μL 的CD133、CD34、VEGFR－2 的一抗，避光保存30 min;加入1 mL 的PBS 離心去上清后，加入300 μL 的PBS，加入1 μL FITC 標(biāo)記的二抗，避光存放30 min;加入1 mL 的PBS 離心去上清后，每管加入150 μL 的PBS 準(zhǔn)備進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測;(3)DIL－ac－LDL 及FITC－UEA－1 雙熒光標(biāo)記 原代細(xì)胞傳代后，培養(yǎng)至第10 d，取消化培養(yǎng)的細(xì)胞，離心后去上清，PBS 漂洗2 min，2次;加入5 mL DIL－ac－LDL (10 μg/mL)，37 ℃孵育1 h;PBS 漂洗2 次;2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min;PBS 漂洗2 次;加入5 mL FITC－ UEA－1(10 μg/mL)，37 ℃孵育1 h。用激光共聚焦顯微鏡觀察。DIL－ac－LDL 和FITC－UEA－1 雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是EPCs。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài) 培養(yǎng)48 h 后即出現(xiàn)梭形細(xì)胞。第4 d 換液后可見細(xì)胞集落形成，中央為圓形細(xì)胞，梭形貼壁細(xì)胞從集落中央以放射狀向外周生長(見圖1)。1 w 以后細(xì)胞生長旺盛，集落邊緣細(xì)胞呈紡錘形近似單層生長。培養(yǎng)約7～10 d 成片生長的細(xì)胞集落相互連接，呈典型的“鵝卵石“樣外觀鋪滿培養(yǎng)瓶(見圖2)。2 w 左右可見由多個(gè)細(xì)胞首尾相連呈魚貫樣排列或兩排細(xì)胞平行排列呈條索狀或管狀結(jié)構(gòu)(見圖3)。

2.2 流式細(xì)胞檢測 結(jié)果見圖4。

2.3 DIL－ac－LDL 及FITC－UEA－1 雙熒光標(biāo)記細(xì)胞的免疫熒光鑒定:將細(xì)胞玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞既能與UEA－1 結(jié)合顯示綠色熒光，又能吞噬ac－LDL 而使胞漿顯示紅色熒光。因而在鏡下顯示紅綠雙熒光的細(xì)胞即認(rèn)定為EPCs (見圖5)。

3 討 論

研究表明，存在于哺乳動(dòng)物外周血、骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一類能定向增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，是干細(xì)胞分化成熟過程的一個(gè)階段，目前大多數(shù)學(xué)者將 CD34+/CD133+/VEGFR－2+的細(xì)胞普遍定義為EPCs［3］。EPCs 具有促進(jìn)新生血管形成及提高微血管密度、促進(jìn)內(nèi)皮再生和提高血管通暢率等作用;不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也在成體血管新生及維持內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)中起著重要的作用［4］。

EPCs 體外培養(yǎng)最初是用免疫磁珠分離出目標(biāo)細(xì)胞群(CD34+、CD133+、VEGFR2+細(xì)胞或任意組合)然后采用貼壁培養(yǎng)法獲得。這種方法雖然得到的細(xì)胞較純，但數(shù)量少，滿足不了實(shí)驗(yàn)研究的需要，且費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜［5］。本實(shí)驗(yàn)利用密度梯度離心聯(lián)合差速貼壁法獲取EPCs，得到的細(xì)胞數(shù)量較多，操作較簡單，經(jīng)過鑒定后基本可以滿足研究要求。首先通過密度梯度離心法從兔骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞，在DMEM 培養(yǎng)基中，向間充質(zhì)干細(xì)胞分化，利用MSCs 常在48 h 內(nèi)貼壁而EPCs 貼壁時(shí)間較長的特點(diǎn)，在48 h 后獲取未貼壁的細(xì)胞，離心后置于含有VEGF、EGF、bFGF 的M199 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3～4 d 換液，觀察細(xì)胞形態(tài)。進(jìn)過鑒定后，符合EPCs 的特點(diǎn)。

目前對于EPCs 的鑒定還沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通常是根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的特性對其進(jìn)行鑒定。包括細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)記及細(xì)胞功能三方面。典型的內(nèi)皮細(xì)胞為長梭形，可成“鋪路石樣”形態(tài)密集排列。EPCs 的常用表面標(biāo)志有:VEGFR－ 2、CD34、CD133 等。功能鑒定包括分析結(jié)合UEA－1 及攝取ac－LDL 的能力［6－7］。因此本研究所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了這三方面的檢測。

通過一系列的細(xì)胞鑒定顯示，本實(shí)驗(yàn)所采用的培養(yǎng)方法能夠在體外成功培養(yǎng) 擴(kuò)增具有典型特征的EPCs，且操作較簡便具，能夠滿足研究需要。同時(shí)以骨髓作為細(xì)胞來源又可實(shí)現(xiàn)自體移植，為“細(xì)胞學(xué)治療”及EPCs 的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。

圖1 4 d 后可見集落形成

圖2 7～10 d 可見類似“鋪路石”樣形態(tài)

圖3 2 w 左右可見由多個(gè)細(xì)胞首尾相連呈魚貫樣排列

圖4 三種表面標(biāo)記抗體的陽性率

圖5 細(xì)胞的免疫熒光鑒定

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