宋慧慧 時(shí)國(guó)朝 (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸科，上海 200025)

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及其功能

蛋白的翻譯后修飾與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯一起共同調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平和活性，常見的蛋白翻譯后修飾包括磷酸化、乙酰化、甲基化等。泛素化是蛋白翻譯后修飾的一種，可對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行廣泛而復(fù)雜的調(diào)控。泛素化是指在泛素活化酶(Ubiquitin activating enzyme，E1)、泛 素 結(jié) 合 酶 (Ubiquitin conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶 (Ubiquitin protein ligase，E3)的連續(xù)作用下，泛素被連接到目標(biāo)蛋白上，標(biāo)記蛋白進(jìn)入蛋白酶體降解或改變蛋白的活性。泛素化是可逆的，去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme，DUB)對(duì)泛素化進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)。泛素、E1、E2、E3和蛋白酶體、DUB構(gòu)成了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system，UPS)［1］。UPS對(duì)底物作用的特異性主要由泛素修飾類型、E3和DUB決定。

首先，泛素是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的多肽，含有不同位點(diǎn)的七個(gè)賴氨酸殘基(Lysine，K)—K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63。在酶的催化下，泛素的C端最終與靶蛋白的K的ε-N端形成異肽鍵，少數(shù)情況下，底物的絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸殘基也是泛素結(jié)合位點(diǎn)。蛋白的泛素化連接可以是單個(gè)泛素或聚泛素鏈(即泛素持續(xù)加入與原有泛素的K形成異肽鍵)，前者稱為單泛素化，后者稱為聚泛素化。值得注意的是，原有泛素的七個(gè)K都可成為新加入泛素的連接位點(diǎn)，因此造成空間構(gòu)象各異的聚泛素鏈，各自介導(dǎo)不同的功能［2］。K48聚泛素化是最常見的泛素修飾類型，通常情況下，K48聚泛素化介導(dǎo)靶蛋白的蛋白酶體降解。K63聚泛素化一般介導(dǎo)非降解功能，但是受體酪氨酸激酶的K63聚泛素化標(biāo)記其進(jìn)入溶酶體降解途徑。K11聚泛素化介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白的降解，單泛素化主要調(diào)控組蛋白和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變［3］。

三種催化酶中，E3在特異識(shí)別底物中最重要，相關(guān)研究也最多。E3包括含有HECT(Homologous to the E6-associated protein C-terminus，HECT)家族、RING(Really interesting new gene，RING)家族和 U-box家族。RING家族成員最多，可以是單體、二聚體或多亞基復(fù)合物，如含有 F-box蛋白的 SCF(SKP1-Cullin1-F-Box)。E3內(nèi)部含有特異識(shí)別某一類底物的結(jié)構(gòu)域，如 Cbl(Casitas B-lineage lymphoma)的酪氨酸激酶結(jié)合(TKB)結(jié)構(gòu)域，NEDD4的WW結(jié)構(gòu)域識(shí)別上皮細(xì)胞鈉通道的PY基序，HSC70羧基末端反應(yīng)蛋白(Carboxy terminus of Hsc70 interacting protein，CHIP)的TRP結(jié)構(gòu)域識(shí)別HSP70、HSC70、HSP90等。E3參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、下調(diào)酪氨酸激酶信號(hào)、參與蛋白質(zhì)量控制、調(diào)節(jié)抑癌蛋白等［4］。E3還可催化自身和其他E3的泛素化，由此形成自我調(diào)節(jié)和自穩(wěn)的網(wǎng)絡(luò)［5］。

DUB可劃分為五類:泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin specific protease，USP)、泛素羧基端水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)、卵巢瘤蛋白酶(Ovarian tumor protease，OTU)、約瑟芬結(jié)構(gòu)域蛋白酶(Machado-Josephin domain protease，MJD)、JAB1/MPN/MOV34金屬蛋白酶(JAB1/MPN/MOV34 metalloprotease，JAMM)，前四類均是半胱氨酸蛋白酶。USP是DUB中最大的一類，現(xiàn)有研究也主要是關(guān)于USP的。DUB可去除泛素化蛋白和泛素化E3的泛素修飾，與E3共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的泛素化平衡。研究表明DUB在NF-κB及TGF-β信號(hào)通路、膜受體內(nèi)吞循環(huán)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA修復(fù)中起到十分重要的作用［6］。

既往研究證明UPS參與惡性腫瘤、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性變?nèi)缗两鹕?、心血管疾病的發(fā)病。下面，我們將著重介紹UPS在T細(xì)胞免疫和哮喘發(fā)病中的研究進(jìn)展。

2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與T細(xì)胞的關(guān)系(見表1)

2．1 CD4+T細(xì)胞活化 E3 Cbl、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)均可負(fù)向調(diào)節(jié) T細(xì)胞活化。Chang等［7］發(fā)現(xiàn)E3 Peli1介導(dǎo)哺乳動(dòng)物核因子-κB(Nuclear factorκB，NF-κB)家族成員 c-Rel的 K48泛素化和降解，負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞活化并抑制自身免疫的發(fā)生。Cai等［8］發(fā)現(xiàn)E3三重基序蛋白27(Tripartite motif containing protein 27，TRIM27)通過(guò)泛素化Ⅱ類磷脂酰肌醇 3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)PI3KC2β，抑制它的激酶活性，負(fù)向調(diào)控CD4+T細(xì)胞活化。Nurieva等［9］研究表明E3 GRAIL(Gene related to anergy in lymphocytes)介導(dǎo)T細(xì)胞活化后期內(nèi)吞CD3的泛素化降解并抑制活化T細(xì)胞核因子(Nuclear factor of activated T cells，NFAT)家族成員NFATc1的表達(dá)，從而限制T細(xì)胞過(guò)度活化。

2．2 Th1細(xì)胞 Cui等［10］發(fā)現(xiàn)黃連素可誘導(dǎo)非肥胖型糖尿病小鼠的1型輔助性T細(xì)胞(helper T lymphocyte 1，Th1)轉(zhuǎn)錄因子STAT4的泛素化降解，進(jìn)而影響Th1的分化。Kriegel等［11］發(fā)現(xiàn)在E3 GRAIL缺陷小鼠體內(nèi)，Th1細(xì)胞因子IFN-γ分泌增加，胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)的蛋白水平和磷酸化水平上升，ERK可能是GRAIL的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

2．3 Th2 細(xì)胞 Swaidani等［12］發(fā)現(xiàn) E3 Act1 可通過(guò)共有的SEFIR(Similar expression to FGF genes and IL-17R)結(jié)構(gòu)域與IL-25受體相互作用，參與IL-25誘導(dǎo)的Th2免疫反應(yīng)和氣道過(guò)敏反應(yīng)。IL-33可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞反應(yīng)并介導(dǎo)肺部炎癥。Funakoshi-Tago等［13］發(fā)現(xiàn)E3 TRAF6是IL-33受體ST2L與下游信號(hào)分子間的銜接蛋白，失去泛素連接酶活性的TRAF6導(dǎo)致 IL-33誘導(dǎo) p38、JNK和 IκB磷酸化受阻。Zhao等［14］發(fā)現(xiàn) E3 FBXL19介導(dǎo) IL-33受體ST2L的泛素化降解，緩解IL-33誘導(dǎo)的肺部炎癥。

2．4 Th17細(xì)胞 Espinosa等［15］發(fā)現(xiàn) E3 Ro52可介導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor，IRF)家族成員的泛素化，負(fù)向調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞因子的生成。Nurieva等［9］研究表明E3 GRAIL抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)中 IL-17、IL-21、ROR γ編碼基因的表達(dá)，維持Treg的免疫抑制功能。

2．5 Foxp3 和 Treg細(xì)胞 Venuprasad 等［16］也發(fā)現(xiàn)E3 Itch使轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)早期基因1(Transforming growth factor-β-inducible early gene 1，TIEG1)泛素化，促進(jìn)TIEG1與Foxp3基因啟動(dòng)子的相互作用，增強(qiáng)Foxp3基因轉(zhuǎn)錄。Chang等［17］發(fā)現(xiàn)特異性剔除Treg中的E2 Ubc13后，Treg的免疫抑制功能下降且促使Treg向Th1和Th17轉(zhuǎn)化，可能是由于Ubc13促進(jìn) IκB激酶(InhibitoryκB kinase，IKK)的泛素化降解并激活NF-κB，激活I(lǐng)L-10基因和細(xì)胞因子信號(hào)抑制物1(Supressor of cytokine signaling 1，SOCS1)基因的轉(zhuǎn)錄。

2．6 CD8+T 細(xì)胞 Hansen等［18］發(fā)現(xiàn)在 CD3γ 鏈的雙亮氨酸基序變異的小鼠體內(nèi)，E3 c-Cbl大量激活，引起鳥苷酸交換因子Vav1的泛素化降解，導(dǎo)致溶細(xì)胞顆粒物質(zhì)胞吐受限，CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用減弱。Hosoi等［19］發(fā)現(xiàn)與編碼腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigens，TAAs)的 mRNA 相比，編碼泛素化TAAs的mRNA可增強(qiáng)TAAs的胞內(nèi)降解和抗原提呈，加強(qiáng)TAA特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。

表1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在T細(xì)胞免疫中的作用及其機(jī)制Tab．1 The effect and mechnism of the ubiquitin-proteasome system in T cell immunity

3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用(見表2)

3．1 過(guò)敏性哮喘 少數(shù)易感人群在接觸過(guò)敏原后發(fā)生過(guò)敏或哮喘反應(yīng)。Srivastava等［20］發(fā)現(xiàn) E3 TRIM27負(fù)向調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的FcεRⅠ活化及其介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。Oh等［21］發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，Cblb缺陷小鼠受過(guò)敏原激發(fā)后，氣道和肺組織的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜增生更加嚴(yán)重，表現(xiàn)出Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)，但是Treg亞群無(wú)明顯改變。Li等［22］發(fā)現(xiàn)在卵清蛋白致敏和激發(fā)的小鼠模型中，E3 Arkadia通過(guò)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorβ，TGF-β)信號(hào)通路負(fù)向調(diào)節(jié)因子Smad7、SnoN和Ski的泛素化降解，增強(qiáng)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)氣道重塑。

3．2 HDAC2和激素抵抗性哮喘 糖皮質(zhì)激素主要通過(guò)招募HDAC2至活化的炎癥基因發(fā)揮其抗炎作用，激素抵抗性哮喘和抽煙哮喘患者體內(nèi)HDAC2顯著下降，恢復(fù)HDAC2的活性和表達(dá)水平是抑制激素抵抗和炎癥反應(yīng)的重要途徑［23］。Adenuga等［24］發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞接觸香煙煙霧提取物(Cigarette smoke extract，CSE)后，引起 HDAC2 的泛素化降解增加。Meja等［25］發(fā)現(xiàn)姜黃素和MG132均可抑制CSE誘導(dǎo)的HDAC2的泛素化降解。以上研究表明，抑制HDAC2的泛素化可能逆轉(zhuǎn)哮喘患者的激素抵抗。

表2 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在哮喘中的作用及其機(jī)制Tab．2 The effect and mechnism of the ubiquitinproteasome system in asthm a

3．3 RSV和兒童型哮喘 對(duì)于部分無(wú)特應(yīng)性體質(zhì)和家族史的兒童型哮喘患者，反復(fù)喘息發(fā)作與急性呼吸道病毒感染有關(guān)，如呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)和腺病毒。Tan等［3］發(fā)現(xiàn) RSV非結(jié)構(gòu)蛋白-1(Nonstructural protein-1，NS-1)對(duì)支氣管上皮細(xì)胞組蛋白H2BD的泛素化修飾導(dǎo)致HOX基因(調(diào)控支氣管發(fā)育)的異常表達(dá)，有可能是RSV感染后肺發(fā)育異常和哮喘發(fā)生的機(jī)制之一。

3．3 NOD2 胞內(nèi)蛋白核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(Nucleotide binding and oligomerization domain 2，NOD2)與胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)結(jié)合可后激活NF-κB，下游信號(hào)分子的泛素化是該通路活化的重要一步。E3 TRAF4、Itch和去泛素化酶A20可負(fù)向調(diào)節(jié) NOD2信號(hào)。由于過(guò)度活化的NOD2參與過(guò)敏性疾病和哮喘的發(fā)生，因此上述E3是否參與哮喘發(fā)病值得我們關(guān)注［26］。

4 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑

Hirose等［27］發(fā)現(xiàn)在抗原激發(fā)前對(duì)哮喘小鼠鼻內(nèi)應(yīng)用IκB泛素化抑制劑GS143可抑制抗原誘導(dǎo)的氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和Th2細(xì)胞因子表達(dá)。Moutzouris等［28］發(fā)現(xiàn)使用蛋白酶體抑制劑MG-132預(yù)處理的人類氣道平滑肌細(xì)胞受TNF-α激發(fā)后，氣道重塑抑制因子MAPK磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1，MKP-1)泛素化降解下降，多種參與哮喘的細(xì)胞因子、趨化因子的分泌減少。但是，Wegmann等［29］運(yùn)用慢性哮喘小鼠模型發(fā)現(xiàn)硼替佐米短期(一周)治療可降低支氣管肺泡灌洗液的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，長(zhǎng)期(六周)治療顯著降低慢性實(shí)驗(yàn)性哮喘小鼠的抗OVA IgE血清滴度。但是，無(wú)論是短期還是長(zhǎng)期治療都不能有效降低漿細(xì)胞數(shù)、抗OVA IgG1血清滴度、過(guò)敏性氣道炎癥或消除氣道高反應(yīng)性。

5 總結(jié)和展望

上述研究表明E3在T細(xì)胞免疫中的重要作用，鑒于哮喘發(fā)病機(jī)制中存在的 Th1/Th2失衡、Treg/Th17失衡以及CD8+T細(xì)胞的參與，E3對(duì)T細(xì)胞調(diào)控作用對(duì)哮喘發(fā)病的影響很值得我們進(jìn)一步的探討。上述研究只是關(guān)于一小部分E3對(duì)T細(xì)胞及哮喘的作用且沒有深入探究E3作用的具體分子，由于E3種類繁多、作用廣泛，研究其他E3及其特異靶蛋白有利于闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制并做特異干預(yù)。盡管IκB泛素化抑制劑和蛋白酶體抑制劑可緩解哮喘模型小鼠的過(guò)敏性炎癥，但是效果并不顯著，極可能是其特異性不高。未來(lái)，在研究哮喘發(fā)病的關(guān)鍵信號(hào)通路和相關(guān)E3的基礎(chǔ)上，根據(jù)相關(guān)E3的特異底物結(jié)合域，設(shè)計(jì)出“假底物”干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或許可以為哮喘的治療提供啟示。

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