高云燕 曹 璐 歐植澤 陳 晨 李 嫕 王雪松

(1西北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院,空間應(yīng)用物理與化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安710072;2中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所,光化學(xué)轉(zhuǎn)換與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100190)

1 引言

順鉑類化合物是目前最有效的抗癌藥物之一.順鉑能與DNA發(fā)生共價相互作用,從而阻止DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡.1,2然而,順鉑的毒副作用大,易于引起中毒性腎損害、嘔吐、神經(jīng)毒性等臨床反應(yīng),且長期使用會產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性.3銅作為體內(nèi)不可缺少的微量元素,參與多種生物化學(xué)反應(yīng).4銅配合物表現(xiàn)出較高的抗癌活性和較低的毒副作用,且具有潛在的腫瘤靶向作用,因而被認(rèn)為是鉑類抗癌藥物的替代藥品之一.5?7

Cu配位化合物在紫外或可見光照射條件下產(chǎn)生的活性氧可氧化DNA的堿基,特別是鳥嘌呤(G);或與DNA的糖基發(fā)生抽氫反應(yīng),表現(xiàn)出較強(qiáng)的DNA光損傷能力.8,9能夠光損傷DNA的化合物有望在生物技術(shù)、過渡金屬藥物領(lǐng)域或光動力治療領(lǐng)域獲得應(yīng)用.10目前大多數(shù)Cu配合物為二價銅配合物,一價銅配合物的光動力作用研究的相對較少.11?13鄰菲羅啉銅(I)對DNA具有識別作用,主要對TAT序列位點(diǎn)具有較高的親和性,并能夠通過羥基自由基等活性氧在結(jié)合位點(diǎn)附近對DNA進(jìn)行損傷.14銅(I)配合物與DNA作用的結(jié)合常數(shù)通常較小(＜105mmol·L?1),15,16且對DNA的損傷效率較低,有時需要較高濃度的配合物或外加還原劑,這限制了Cu(I)配合物的進(jìn)一步應(yīng)用.17,18近年來,通過引入多個金屬中心、合成不同結(jié)構(gòu)的鄰菲羅啉配體,調(diào)節(jié)鄰菲羅啉銅配合物的氧化還原電位及其與DNA的結(jié)合方式,可以有效地促進(jìn)鄰菲羅啉銅配合物對DNA的氧化斷裂.19聯(lián)吡啶[3,2-a:2?,3?-c]-氮雜-吩嗪(dpapz)是一種具有較大共軛芳香環(huán)的鄰菲羅啉衍生物配體,其釕配合物與DNA具有較強(qiáng)的相互作用.20?22但是dpapz及其相關(guān)配合物的光物理性質(zhì)、光損傷DNA的機(jī)理尚未得到詳細(xì)研究.本文通過改進(jìn)dpapz的合成方法,提高了產(chǎn)率,進(jìn)一步制備得到[Cu(dpapz)2]PF6配合物,采用多種光譜方法研究了配合物與DNA的作用方式,并對其光損傷DNA的機(jī)制進(jìn)行了探討.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

小牛胸腺DNA(CT DNA)、溴乙錠(EB)、[Cu(CH3CN)4]PF6均為分析純試劑(純度大于99%),購自美國Aldrich公司.硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、對苯醌(PBQ)、9,10-二苯基蒽(DPA)、1,4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷(DABCO)、3,4-二氨基吡啶均為分析純試劑(純度大于99%),購自美國Acros公司.1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮參照文獻(xiàn)23合成.其余試劑均為分析純,購自北京化工廠.所有溶劑經(jīng)無水處理,使用前重蒸.所用緩沖溶液均為Tris-HCl溶液(10 mmol·L?1,pH 7.0),采用二次蒸餾水配制.CT DNA溶液按照文獻(xiàn)24的方法配制,并利用260 nm處的吸光度確定CT DNA的濃度(摩爾消光系數(shù)為6600 mol·L?1·cm?1).

所用儀器:Hitachi U-3100紫外-可見吸收光譜儀,日本;Hitachi F-4600熒光分光光度計(jì),日本;Bio-Rad Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng),美國;Bruker Avance 400核磁共振波譜儀,德國;Waters GCT Premier高分辨質(zhì)譜儀(HR ESI-MS),美國;北京六一DYCP-44N凝膠電泳儀,上海華辰CHI 660D電化學(xué)分析儀.

2.2 配合物的合成與表征

2.2.1 配體dpapz的合成

將 1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮(0.5 g,2.5 mmol)和3,4-二氨基吡啶(0.5 g,4.5 mmol)溶于50 mL重蒸無水乙醇中,80°C回流6 h,得黃色溶液,冰水浴冷卻1 h后有固體析出,抽濾,用冷的無水乙醇洗滌,干燥,得淺黃色固體0.55 g,產(chǎn)率為75%.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.778(s,1H);9.547(m,2H);9.274(m,2H);8.945(d,1H);8.106(d,1H);7.766(m,2H).IR(KBr),ν/cm?1:3060 w,1577 s,1529 m,1473 m,1433 m,1388 m,1342 m,1247 w,1220 w,1124 m,1070 m,1026 m,977 m,893 m,821 s,739 s,628 m,580 m.

2.2.2 配合物[Cu(dpapz)2]PF6(2)的合成

將dpapz(76 mg,0.2682 mmol)溶于5 mL重蒸氯仿,通入氮?dú)獬?0 min后,緩慢加入5 mL[Cu(CH3CN)4]PF6(50 mg,0.1341 mmol)的甲醇溶液,50°C下反應(yīng)6 h,有棕黑色沉淀產(chǎn)生.沉淀用二次蒸餾水、丙酮和無水乙醚洗滌數(shù)次后真空干燥,得棕黑色固體60 mg,產(chǎn)率為71%.1H NMR(DMSO-d6)δ:9.860(br s,6 H),9.083(bs s,6 H),8.311(br s,3 H).HR ESI-MS(MeCN):629.0985,[C34H18CuN10],m/z=629.1011([M-PF6]+).元素分析:實(shí)驗(yàn)值(計(jì)算值)(%),C 64.72(64.81),H 2.94(2.88);N 22.34(22.23).IR(KBr),ν/cm?1:3084 w,1588 m,1487 m,1446 m,1380 s,1346 m,1299 m,1139 m,1080 m,831 m,729 m,640 m,582 m.

2.3 紫外-可見滴定實(shí)驗(yàn)

配制 dpapz(10 μmol·L?1)及[Cu(dpapz)2]PF6(5 μmol·L?1)的緩沖溶液,逐漸滴加DNA(初始濃度為1.5 mmol·L?1)溶液,室溫靜置15 min.采用1 cm石英比色皿,以相應(yīng)濃度DNA的緩沖溶液為參比,測定230?750 nm范圍內(nèi)的紫外-可見光譜.

2.4 溴乙錠(EB)熒光競爭實(shí)驗(yàn)

用緩沖溶液配制試樣,固定CT DNA濃度為10 μmol·L?1,EB 濃度為5 μmol·L?1,將反應(yīng)液混合均勻,室溫靜置2 h后,逐漸增大dpapz及其Cu(I)配合物的濃度,靜置15 min進(jìn)行熒光光譜測試,激發(fā)波長為510 nm,掃描范圍為530?750 nm.

2.5 DNA熔解曲線的測定

用緩沖溶液配制試樣,固定CT DNA濃度為50 μmol·L?1,dpapz濃度為20 μmol·L?1,或[Cu(dpapz)2]PF6濃度為 10 μmol·L?1,將反應(yīng)液混合均勻,室溫靜置2 h后,由24°C逐漸加熱到96°C,升溫速率控制為1°C·min?1.將雙鏈CT DNA在260 nm處的吸收變化值分別進(jìn)行歸一化后對溫度作圖,中間拐點(diǎn)處的溫度即為DNA的熔解溫度.

2.6 循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)

工作電極使用玻碳電極,對電極使用鉑電極,參比電極使用飽和甘汞電極(SCE),實(shí)驗(yàn)前待測溶液通氮?dú)獬鯕?0 min,實(shí)驗(yàn)過程中始終保持氮?dú)鈿夥?配制30 μmol·L?1dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6的緩沖溶液,支持電解質(zhì)為50 mmol·L?1NaCl,測定加入CT DNA前后化合物的峰電位和峰電流的變化,掃描速率為0.1 V·s?1,測定?1.2?0.5 V范圍的循環(huán)伏安曲線.

2.7 超氧負(fù)離子自由基()測試

配體dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6的超氧負(fù)離子自由基產(chǎn)生能力通過硝基四氮唑藍(lán)(NBT)與O2?·的反應(yīng)測定.25光源為300 W高壓汞燈(λ＞300 nm).光照dpapz及其配合物(10 μmol·L?1)與NBT(50 μmol·L?1)的DMSO混合溶液,每隔3 min取樣,利用600 nm處的吸收變化值對光照時間作圖得到的曲線可比較不同光敏劑產(chǎn)生超氧負(fù)離子自由基的能力.

2.8 單重態(tài)氧(1O2)的測定

配體dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6的1O2量子產(chǎn)率采用9,10二苯基蒽(DPA)光氧化法測定.26固定DPA的濃度為8×10?5mol·L?1,采用300 W高壓汞燈(λ＞300 nm)樣品,每隔10 min取樣,測定其紫外可見吸收光譜.利用DPA在374 nm處吸收值降低程度與光照時間的關(guān)系作圖,可比較不同光敏劑產(chǎn)生單重態(tài)氧的相對量子效率.

2.9 DNA光損傷實(shí)驗(yàn)

取30μL pBR322 DNA溶液(0.5μg·mL?1,pH 7.0)與dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6溶液混合,室溫暗處靜置20 min后,采用高壓汞燈光照20 min(λ＞300 nm).利用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進(jìn)行分離,溴乙錠染色后,采用Bio-Rad Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)測定DNA相應(yīng)組分的熒光強(qiáng)度.獲得超螺旋結(jié)構(gòu)DNA(Form I,supercoiled)、帶切口的DNA(Form II,nicked)和線性DNA(Form III,linear)的相對百分含量.

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物合成

通過提高反應(yīng)物3,4-二氨基吡啶和1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮的投料比,改變反應(yīng)溶劑和延長反應(yīng)時間,配體聯(lián)吡啶[3,2-a:2?,3?-c]-7-氮雜-吩嗪(dpapz)的收率由文獻(xiàn)21報道的42%提高到75%.配體dpapz與[Cu(CH3CN)4]PF6在CHCl3和甲醇的混合溶劑中回流可得到配合物[Cu(dpapz)2]PF6(圖1).配體dpapz的結(jié)構(gòu)不具有對稱性,鄰菲羅啉環(huán)上氫原子的1H NMR譜圖表現(xiàn)出多重峰(圖2(a)).與Cu(I)配位后,dpapz的鄰菲羅啉環(huán)上2位氫原子的1H NMR峰位明顯向低場移動,表明Cu(I)主要與配體的鄰菲羅啉部分配位,而不是與吡啶環(huán)部分配位(圖2(b)).[Cu(dpapz)2]PF6的1H NMR峰均為寬峰(圖2(b)),可能是Cu(I)配合物在溶液中形成了無定形聚集態(tài)引起的.27紅外光譜顯示,dpapz在3060 cm?1處的C―Harom伸縮振動峰在配位后向高波數(shù)方向移至3084 cm?1.同時,dpapz在1400?1600 cm?1范圍內(nèi)的鄰菲羅啉部分的特征峰在配位后均發(fā)生了明顯的位移,進(jìn)一步表明鄰菲羅啉基團(tuán)參與了配位.28

高分辨質(zhì)譜圖中,629.0985處的峰可歸屬于[Cu(dpapz)2]+的分子離子峰(理論值為m/z=629.1012),387.0408處的峰可歸屬于[Cu(dpapz)(CH3CN)]+的分子離子峰(理論值為m/z=387.0419)(圖3).同時還可觀測到dpapz配體在284.0919處的分子離子峰(理論值為m/z=284.0858).盡管質(zhì)譜圖中能觀測到[Cu(dpapz)(CH3CN)]+的分子離子峰,但在配合物的紅外圖譜中未能觀測到CH3CN的特征紅外吸收,因此[Cu(dpapz)(CH3CN)]+的分子離子峰可能是質(zhì)譜檢測過程中產(chǎn)生的.如果配體dpapz與Cu2+配位,應(yīng)該可以檢測到[Cu(II)(dpapz)2]2+的分子離子峰(m/z=314.5506),或的分子離子峰(m/z=774.0659).但是在高分辨質(zhì)譜圖中沒有檢測到這些Cu2+配合物的質(zhì)譜峰(圖3).說明dpapz主要與銅(I)配位形成配合物,且配合物[Cu(dpapz)2]PF6具有良好的穩(wěn)定性.實(shí)驗(yàn)過程中,溶劑經(jīng)過嚴(yán)格處理,采用Cu(NO3)2等二價銅化合物與dpapz配位時,最終產(chǎn)物也只有Cu(I)配合物.一價銅離子的電子構(gòu)型為d10,傾向于形成四面體空間結(jié)構(gòu);而二價銅離子的電子構(gòu)型為d9,主要形成具有更好平面結(jié)構(gòu)的配合物.由于鄰菲羅啉類配體具有較大的空間位阻,使得具有平面結(jié)構(gòu)的二價銅配合物相對不穩(wěn)定,在還原劑存在條件下,鄰菲羅啉衍生物的銅(II)配合物易于被還原形成銅(I)配合物.29,30文獻(xiàn)報道,Cu2+能被溶劑中存在的微量還原劑或溶劑本身還原,反應(yīng)生成Cu(I)配合物,具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究.31,32

圖1 配體dpapz和配合物[Cu(dpapz)2]PF6的合成路線Fig.1 Synthetic routes for the ligand dpapz and the complex[Cu(dpapz)2]PF6

圖2 (a)配體dpapz和(b)配合物[Cu(dpapz)2]PF6的1H NMR圖Fig.2 1H NMR spectra of ligands(a)dpapz and(b)[Cu(dpapz)2]PF6

圖3 [Cu(dpapz)2]PF6在乙腈溶劑中的HR ESI質(zhì)譜圖Fig.3 High resolution electrospray ionization mass spectrum(HR ESI-MS)of complex[Cu(dpapz)2]PF6in acetonirile

3.2 紫外吸收光譜

配體dpapz在261、290、301和359 nm處有四個吸收峰,其中261、290和301 nm處的峰可歸屬于配體的π→π*躍遷,而359 nm處的吸收為配體的n→π*躍遷(圖4(a)).33隨著CT DNA的加入,dpapz的各吸收峰的強(qiáng)度逐漸下降.當(dāng)CT DNA與dpapz的濃度比為2.5時,261和290 nm處吸收峰的減色效應(yīng)分別為27.9%和23.4%,表明CT DNA與dpapz具有較強(qiáng)的相互作用.配體dpapz與CT DNA的結(jié)合常數(shù)可以通過公式(1)求得:

式中,D為 DNA的濃度,Δεap=|εa?εf|,Δε=|εb?εf|,εa為化合物的表觀消光系數(shù)(εa=Aobs/[化合物]),即用加入不同濃度DNA后化合物的吸光度值A(chǔ)obs除以化合物濃度得到.εf為未加入DNA時,化合物的消光系數(shù).εb為所有的化合物與DNA結(jié)合后的消光系數(shù).Ka為化合物與DNA的結(jié)合常數(shù).以D/Δεap對D作圖,線性擬合后得到的斜率與相應(yīng)截距的比值為結(jié)合常數(shù).利用dpapz在261 nm處的吸收峰強(qiáng)度的變化進(jìn)行線性擬合,求得dpapz與DNA的結(jié)合常數(shù)為2.88×105mol·L?1.

配合物[Cu(dpapz)2]PF6在267和361 nm處有兩個主要吸收峰,在289和301 nm處可觀測到兩個肩峰(圖4(b)).隨著CT DNA的加入,這些峰的強(qiáng)度明顯下降.當(dāng)CT DNA與[Cu(dpapz)2]PF6的濃度比為2.5時,267和361 nm處吸收峰的減色效應(yīng)分別為75.9%和57.0%,且吸收峰分別紅移至270和363 nm處.利用267 nm處吸收峰強(qiáng)度的變化進(jìn)行線性擬合作圖,求得[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的結(jié)合常數(shù)為 5.32×105mol?1·L.[Cu(dpapz)2]PF6與 CT DNA 的結(jié)合常數(shù)與文獻(xiàn)20報道的dpapz釕配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)相當(dāng).配體結(jié)構(gòu)對銅配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)和相互作用方式有較大影響.文獻(xiàn)15,16報道鄰菲羅啉或含吡啶環(huán)希夫堿的Cu(I)配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)分別為4.7×104,7.23×104mol?1·L.而dpapz具有較大的芳香環(huán)面積,因而[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的結(jié)合常數(shù)較高.

加入CT DNA后,[Cu(dpapz)2]PF6的減色效應(yīng)大于dpapz,且CT DNA與[Cu(dpapz)2]PF6的結(jié)合常數(shù)大于與dpapz作用的結(jié)合常數(shù),說明[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的作用要強(qiáng)于dpapz.文獻(xiàn)報道,當(dāng)化合物以插入方式與DNA結(jié)合時,其吸收光譜會表現(xiàn)出減色效應(yīng)或者峰位的紅移.34但對Cu(dpapz)2]PF6而言,加入DNA后,配合物的吸收峰紅移較小(2?3 nm),且二者的結(jié)合常數(shù)要小于經(jīng)典的DNA插入作用化合物(如[Ru(phen)2(DPPZ)]2+和溴乙錠(EB)等)與DNA作用的結(jié)合常數(shù)(106?107mol?1·L),35,36這說明[Cu(dpapz)2]PF6與DNA的作用可能為部分插入作用.與配體dpapz相比,[Cu(dpapz)2]PF6具有金屬離子中心,還能夠通過靜電作用和CT DNA結(jié)合,因此[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的作用要強(qiáng)于配體dpapz本身.

圖4 不同濃度CT DNA存在下(a)dpapz和(b)[Cu(dpapz)2]PF6的紫外吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of(a)dpapz and(b)[Cu(dpapz)2]PF6with different concentrations of CT DNA

3.3 CT DNA熔解溫度

熔解作用是DNA的一個極其重要的物理化學(xué)性質(zhì).測定DNA的熔解溫度(Tm)是研究化合物對DNA穩(wěn)定性影響的常用方法.在Tris-HCl緩沖溶液中,CT DNA的熔解溫度為72.0°C(圖5).加入dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6后,CT DNA的熔解溫度分別上升為79.8 °C(ΔTm=7.8 °C)、83.1 °C(ΔTm=11.1 °C),說明dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6均能很好地穩(wěn)定CT DNA.化合物與雙鏈DNA以扦插方式作用時能引起DNA的熔解溫度上升10°C以上.37因此,[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA具有扦插作用,這與紫外吸收光譜測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.而dpapz使得CT DNA的熔解溫度上升相對較小(7.8°C),且dpapz與CT DNA作用時未觀察到吸收峰紅移并且減色效應(yīng)較小(圖4(a)),進(jìn)一步表明dpapz與CT DNA的結(jié)合不是扦插作用,而可能采取溝槽結(jié)合的方式與CT DNA發(fā)生相互作用.38

3.4 與溴乙錠的競爭實(shí)驗(yàn)

溴乙錠為共軛芳香環(huán)的平面分子,是一種熒光染料,其本身熒光強(qiáng)度很弱,當(dāng)EB插入DNA堿基對時,形成EB-DNA復(fù)合物,使得其熒光大為增強(qiáng).若其它不產(chǎn)生熒光的分子與DNA作用時,部分地將EB從EB-DNA復(fù)合物中擠出,從而導(dǎo)致EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度減弱,根據(jù)Stern-Volmer方程(公式(2))得到化合物的熒光猝滅常數(shù):39

式中I0和I分別為加入配體或配合物前后EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度,r=[complex]/[DNA],KSV為猝滅常數(shù).

隨著dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6濃度的增加,EBDNA體系在592 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減小(圖6).以I/I0對r作圖,求得dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6的熒光猝滅常數(shù)分別為4.52和9.86.[Cu(dpapz)2]PF6以扦插作用的方式與DNA結(jié)合,能夠與EB競爭DNA堿基對的作用位點(diǎn),因而具有較大的熒光猝滅常數(shù).40而配體dpapz以溝槽作用的方式與DNA結(jié)合,與DNA作用相對較弱,因而熒光猝滅常數(shù)相對較小.41

圖5 加入dpapz(20 μmol·L?1),[Cu(dpapz)2]PF6(10 μmol·L?1)對CT DNA(50 μmol·L?1)的熔解溫度的影響Fig.5 Normalized melting curves of CT DNA(50 μmol·L?1)with the addition of dpapz(20 μmol·L?1),[Cu(dpapz)2]PF6(10 μmol·L?1)

圖6 (a)dpapz和 (b)[Cu(dpapz)2]PF6對 EB-DNA體系熒光光譜的影響Fig.6 Emission spectra of EB-DNAin the absence and presence of(a)dpapz and(b)[Cu(dpapz)2]PF6

3.5 循環(huán)伏安測試

電化學(xué)方法是研究體系氧化還原性能的重要方法,也可以對光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行有力的補(bǔ)充,有利于更深入地了解化合物與CT DNA的作用方式.在Tris-HCl緩沖溶液中,dpapz的還原電位分別位于?0.362和?1.025 V(vsSCE),可歸屬于吩嗪42和鄰菲羅啉環(huán)43的還原電位峰(圖7(a)).加入DNA后,dpapz的還原峰位和峰電流都變化較小,說明dpapz以非插入方式與DNA作用.44

圖7 (a)dpapz(30 μmol·L?1)和(b)[Cu(dpapz)2]PF6(30 μmol·L?1)與0和10 μmol·L?1CT DNA在10 mmol·L?1 Tris-HCl,50 mmol·L?1NaCl緩沖溶液(pH 7.0)中相互作用的循環(huán)伏安曲線Fig.7 Cyclic voltammograms of(a)dpapz(30 μmol·L?1)and(b)[Cu(dpapz)2]PF6(30 μmol·L?1)in the presence of 0 and 10 μmol·L?1CT DNAin Tris-HCl(10 mmol·L?1,pH 7.0)buffer containing NaCl(50 mmol·L?1)

[Cu(dpapz)2]PF6在Tris-HCl緩沖溶液的還原電位分別位于?0.440和?1.110 V(vsSCE)(圖7(b)),要低于配體相應(yīng)的還原電位.加入CT DNA后,[Cu(dpapz)2]PF6的還原峰分別正移至?0.410和?1.080 V(vsSCE),且峰電流明顯下降,說明配合物中dpapz配體部分與CT DNA有較強(qiáng)的相互作用.一般來說,插入作用導(dǎo)致金屬配合物還原峰電勢正移.同時,配合物與DNA進(jìn)行插入作用形成穩(wěn)定配合物后,溶液中自由配合物濃度降低,使得單位時間內(nèi)遷移至電極表面的配合物分子數(shù)減少,從而導(dǎo)致配合物的還原峰電流降低.45在0.1398和0.2534 V(vsSCE)處分別還可檢測到一對可逆的氧化還原峰,可歸屬于[Cu(dpapz)2]PF6中的Cu(II)/Cu(I)的氧化還原峰.46加入DNA后,[Cu(dpapz)2]PF6中Cu(II)/Cu(I)的還原峰由0.1398 V正移至0.1409 V(vsSCE),而氧化峰則由0.2534 V正移至0.2978 V(vsSCE),說明Cu(I)離子也參與了配合物與DNA的相互作用.但是Cu(II)/Cu(I)的氧化峰電流和還原峰電流在加入DNA后都增加,說明配合物[Cu(dpapz)2]PF6中Cu(I)與DNA作用方式可能是靜電相互作用.47Cu(I)配合物一般采取四面體結(jié)構(gòu)配位,因而配體與DNA進(jìn)行部分插入作用,而Cu(I)離子本身采取靜電作用的方式與DNA結(jié)合,12這也與紫外吸收和DNA溶解溫度變化實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符合.

3.6 超氧負(fù)離子自由基的產(chǎn)生

圖8 三乙胺存在下利用硝基四氮唑藍(lán)(NBT,50 μmol·L?1)法測定dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6的O2??的產(chǎn)率Fig.8 Relative quantum yields of O2?? by dpapz and[Cu(dpapz)2]PF6via nitro blue tetrazolium(NBT,50 μmol·L?1)method in the presence of triethylamine

3.7 單重態(tài)氧的產(chǎn)生

9,10-二苯基蒽(DPA)能與單重態(tài)氧發(fā)生環(huán)加成反應(yīng),并引起DPA的吸收下降.通過比較DPA的特征吸收峰在374 nm處的下降(圖9),可了解光敏劑產(chǎn)生單重態(tài)氧的能力.圖9插圖為[Cu(dpapz)2]PF6和DPA的乙醇溶液經(jīng)光照后,在350?400 nm范圍內(nèi)吸收光譜的變化.加入單重態(tài)氧猝滅劑DABCO后,溶液的吸收光譜的下降明顯減弱,說明DPA的吸收下降是由于單重態(tài)氧引起的.圖9的結(jié)果表明[Cu(dpapz)2]PF6和dpapz產(chǎn)生單重態(tài)氧的能力相當(dāng).

3.8 DNA的光損傷測定

超螺旋結(jié)構(gòu)雙鏈質(zhì)粒DNA(Form I)中的一條DNA鏈段受到損傷時,可形成結(jié)構(gòu)相對松弛的環(huán)狀DNA(單鏈斷裂,Form II).環(huán)狀DNA的切口附近發(fā)生損傷后,進(jìn)一步形成線性DNA(雙鏈斷裂,Form III).49利用瓊脂糖凝膠電泳可將這三種具有不同構(gòu)象的DNA進(jìn)行分離,并采用凝膠成像儀進(jìn)行定量分析.本文采用pBR322 DNA作為模型DNA,研究光照條件下dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6對DNA的光損傷作用.將dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6與DNA暗處靜置20 min,或單獨(dú)光照DNA溶液均未觀測到明顯的DNA損傷,僅有少量的Form II結(jié)構(gòu)DNA(相對含量＜5%),可能是DNA自發(fā)裂解引起的(圖10(a)Lane 1和圖10(b)Lane 1).當(dāng)采用高壓汞燈光照dpapz與DNA 的混合溶液 20 min時(λ＞300 nm),pBR322 DNA的組成發(fā)生了變化,超螺旋結(jié)構(gòu)DNA的含量為55.31%(圖10(a)Lane 2和圖10(b)Lane 2).而[Cu(dpapz)2]PF6與DNA溶液經(jīng)過光照20 min后,大部分質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)變成為環(huán)狀DNA(54.97%)或線性DNA(38.01%),僅剩余少部分超螺旋結(jié)構(gòu)DNA(7.02%)(圖10(a)Lane 6和圖10(b)Lane 6),說明[Cu(dpapz)2]PF6對DNA的光損傷作用要強(qiáng)于配體dpapz.

圖9 9,10-二苯基蒽(DPA,80 μmol·L?1)光氧化法測定dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6在乙醇中的單重態(tài)氧量子產(chǎn)率Fig.9 9,10-Diphenylanthracene(DPA,80 μmol·L?1)bleaching method for measuring the quantum yields of 1O2of dpapz and[Cu(dpapz)2]PF6in ethanol solution

加入不同活性氧的猝滅劑,可研究光敏劑光損傷DNA的機(jī)理.加入超氧負(fù)離子自由基猝滅劑對苯醌PBQ后,dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6對DNA的光損傷作用明顯減弱,超螺旋結(jié)構(gòu)DNA的含量分別升高為65.26%和57.89%(圖10(a),Lanes 3和7;圖10(b),Lanes 3和7).而單重態(tài)氧猝滅劑DABCO和羥基自由基猝滅劑甘露醇的加入對dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6光損傷DNA的影響相對較小(圖10(a)Lanes 4,5,8和9;圖10(b),Lanes 4,5,8和9).上述結(jié)果表明,超氧負(fù)離子自由基、單重態(tài)氧和羥基自由基均參與了dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6的DNA光損傷作用.

圖10 (a)dpapz(5 μmol·L?1)和[Cu(dpapz)2]PF6(5 μmol·L?1)光損傷pBR322質(zhì)粒DNA的瓊脂凝膠電泳圖;(b)不同泳道中質(zhì)粒DNA成分的百分含量Fig.10 (a)Agrose gel electrophoresis patterns of pBR322 plasmid DNAfor the light-induced DNAcleavage activity of dpapz(5 μmol·L?1)and[Cu(dpapz)2]PF6(5 μmol·L?1);(b)the percentage of plasmid DNAform in different lanes

DNA中的G堿基具有較低的氧化電位,能夠與多種光敏劑發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng).50配體dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6與DNA發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成負(fù)離子自由基和DNA正離子自由基(公式(3)).而dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6負(fù)離子自由基與氧反應(yīng)生成超氧負(fù)離子自由基(公式(4)),超氧負(fù)離子自由基以及通過歧化反應(yīng)生成的羥基自由基都可以損傷DNA,這使得超氧負(fù)離子自由基成為引起DNA損傷的主要活性氧物種.[Cu(dpapz)2]PF6通過靜電作用和部分扦插作用等多種方式與DNA作用,結(jié)合常數(shù)更高,因而[Cu(dpapz)2]PF6產(chǎn)生的活性氧能夠更有效地對DNA進(jìn)行光損傷.

4 結(jié)論

合成了dpapz及其配合物[Cu(dpapz)2]PF6,并采用多種方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.[Cu(dpapz)2]PF6具有良好的穩(wěn)定性,保持了產(chǎn)生超氧負(fù)離子自由基和單重態(tài)氧的能力.[Cu(dpapz)2]PF6通過靜電作用和部分扦插作用與DNA結(jié)合,具有較高的結(jié)合常數(shù).在光照條件下,[Cu(dpapz)2]PF6光損傷DNA的效率明顯高于配體dpapz,說明選擇合適的配體是增強(qiáng)Cu(I)配合物對DNA的親和性和提高DNA光損傷能力的有效途徑.

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