孫明雪，劉繼棟，堵國(guó)成,2，周景文，陳堅(jiān),2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122

芳樟醇屬于非環(huán)單萜醇，是一種植物次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，在食品、香化、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域均具有重要應(yīng)用價(jià)值[2]。目前，芳樟醇的合成主要采用植物提取和化學(xué)合成兩種方法?；瘜W(xué)合成方法通常比較昂貴，并且由于萜類(lèi)物質(zhì)具有特定的親和性和專(zhuān)一性，通常只能較為經(jīng)濟(jì)地合成部分結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的萜類(lèi)[3]。從天然芳香植物中提取單萜因產(chǎn)量和提取效率較低、易受各種自然因素影響，導(dǎo)致大部分單萜類(lèi)化合物的價(jià)格居高不下[4]。利用微生物細(xì)胞合成單萜，因其原料來(lái)源廣泛、產(chǎn)物單一且生產(chǎn)周期短，成為替代植物提取和化學(xué)合成的方法之一[5]。

目前以釀酒酵母作為合成萜類(lèi)物質(zhì)的真核表達(dá)系統(tǒng)正日益得到研究者的重視[6-7]。釀酒酵母通過(guò)內(nèi)源類(lèi)異戊二烯代謝途徑提供香葉基二磷酸(GPP)，可作為單萜生物合成的前體物質(zhì)(圖1)[8]。2007年，Oswald 等在釀酒酵母中引入仙女扇Clarkia breweri 來(lái)源的芳樟醇合成酶基因，但是由于異源芳樟醇合成酶表達(dá)量過(guò)低，導(dǎo)致檢測(cè)不到目的產(chǎn)物芳樟醇[9]。2008年，Herrero等在野生型釀酒酵母的類(lèi)異戊二烯生物合成途徑上引入芳樟醇合成代謝支路，成功構(gòu)建重組菌株并且能夠有效分泌芳樟醇[10]。2010年，Rico等在釀酒酵母中成功表達(dá)了仙女扇來(lái)源的芳樟醇合成酶基因，并通過(guò)調(diào)節(jié)類(lèi)異戊二烯生物合成途徑使芳樟醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高，達(dá)到30.19μg/L[11]。

圖1 釀酒酵母中類(lèi)異戊二烯代謝途徑(包括芳樟醇合成支路)Fig.1 Isoprenoid pathway in Saccharomyces cerevisiae,including the branch point to (S)-linalool.Dotted arrows indicate that more than one reaction is required to convert the substrate to the product indicated.Dashed arrows indicate the engineered steps.

為了獲得高產(chǎn)芳樟醇的釀酒酵母工程菌株，本研究在已經(jīng)成功表達(dá)來(lái)源于軟棗獼猴桃Actinidia arguta 的芳樟醇合成酶基因的基礎(chǔ)上[12]，進(jìn)一步調(diào)控類(lèi)異戊二烯生物合成途徑，增加芳樟醇合成前體的供給，實(shí)現(xiàn)了對(duì)tHMG1與IDI1基因的調(diào)控，使芳樟醇的產(chǎn)量提高了1.3倍，從(59.85±4.05)μg/L 增加至(127.71±7.68)μg/L。本研究在釀酒酵母工程菌中獲得較高的芳樟醇產(chǎn)量，為實(shí)現(xiàn)芳樟醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工具酶及試劑

芳樟醇(97%)購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、ExTaq DNA 聚合酶、pMD18-T Simple Vector、感受態(tài)制備試劑盒、膠回收、片段回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。各種化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株及質(zhì)粒如表1所示。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉10 g/L，需要時(shí)加入氨芐青霉素至終濃度為100μg/mL；YNB 液體培養(yǎng)基：硫酸銨5 g/L，YNB 1.7 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 調(diào)至5.6，115℃滅菌15 min，滅菌后加入過(guò)濾除菌的卡那霉素至終濃度為100μg/mL。根據(jù)需要選擇添加亮氨酸、組氨酸、色氨酸、尿嘧啶等，使其在培養(yǎng)基中終濃度為50μg/mL，氨基酸溶液在105℃滅菌10 min；YPD 液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，115℃滅菌15 min，在滅菌后加入過(guò)濾除菌的卡那霉素至終濃度為100μg/mL。固體培養(yǎng)基均在液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂粉。

表1 本研究中所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.4 搖瓶培養(yǎng)條件

種子液的制備：將重組菌從氨基酸缺陷型平板上刮取一單菌落至20 mL YNB 液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h 后，即為種子液。重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)接種子液至50 mL 新鮮YPD液體培養(yǎng)基，使OD600達(dá)到0.05，在30℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h。

1.2 方法

1.2.1 DNA 片段的擴(kuò)增與重組

以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組為模板，用引物IDI1-R 和IDI1-F 擴(kuò)增IDI1基因序列(引物序列見(jiàn)表2)，獲得基因長(zhǎng)度867 bp 的IDI1基因。PCR 程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與載體連接pMD18-T Simple，陽(yáng)性克隆小量抽提質(zhì)粒酶切鑒定，并進(jìn)行DNA 測(cè)序。將序列正確并純化的PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)NotⅠ和SacⅡ雙酶切，連接至經(jīng)相同限制性?xún)?nèi)切酶酶切的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pYLIS 中，獲得AaLS1基因與IDI1基因共表達(dá)載體pYLIS-IDI1。

tHMG1基因是HMG-CoA 還原酶具有催化作用的蛋白C 末端編碼區(qū)域[15]。以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組為模板，用HMG1-R 和HMG1-F 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增tHMG1基因(引物序列見(jiàn)表2)，獲得基因長(zhǎng)度1578 bp 的tHMG1基因。PCR 程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接 pMD18-TSimple，小量抽提質(zhì)粒酶切鑒定，進(jìn)行DNA 測(cè)序。將序列正確并純化的PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切，連接至經(jīng)相同限制性?xún)?nèi)切酶酶切的釀酒酵母整合表達(dá)載體pRS305-TEF1中，獲得tHMG1基因整合表達(dá)載體pRS305-tHMG1。

表2 PCR 擴(kuò)增所需引物Table 2 Primers used for PCR amplification

1.2.2 重組菌株的構(gòu)建

釀酒酵母轉(zhuǎn)化均采用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化方法[16]。轉(zhuǎn)化后涂布于相對(duì)應(yīng)的氨基酸缺陷YNB平板，挑選轉(zhuǎn)化子，菌落PCR 驗(yàn)證。

1.2.3 氣相色譜與質(zhì)譜(GC-MS)分析與檢測(cè)

在20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，加入2 g NaCl，注入5 mL 預(yù)冷的發(fā)酵溶液樣品，加蓋密封墊和鋁帽，壓緊。頂空吸附溫度95℃保溫30 min。使用Shimadzu GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。色譜條件：Rax-Wax 色譜柱(30 m×0.25 mm ×0.25μm)；程序升溫條件：初始溫度60℃，保持30 s，以8℃/min升溫至100℃，立即以30℃/min升溫至200℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度為240℃，載氣(氦氣)流速為1 mL/min；不分流。質(zhì)譜條件：EI 電離源，電子能量70 eV；質(zhì)量掃描方式：選擇離子掃描：m/z 71，93和121；定量離子71。

采用外標(biāo)法測(cè)定芳樟醇樣品的濃度，計(jì)算結(jié)果取3個(gè)平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的平均值；配制4個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為10、100、1000、10000μg/L，分別測(cè)定在GC-MS 上的響應(yīng)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 麥角固醇測(cè)定方法

采用吸光度法測(cè)定釀酒酵母菌株麥角固醇含量，具體測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[17]。其中菌體干重(Dry cell weight)測(cè)定方法，首先收集發(fā)酵液，4000 r/min 離心10 min，蒸餾水洗滌菌體1～2次后取沉淀，60℃烘至恒重，稱(chēng)重。

2 結(jié)果與分析

2.1 IDI1基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組DNA 為模板，采用PCR 法擴(kuò)增IDI1基因，擴(kuò)增出特異性譜帶，大小約為867 bp。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將序列正確PCR 產(chǎn)物經(jīng)NotⅠ和SacⅡ酶切并純化后，與經(jīng)相同酶切的載體pYLIS 連接。在含有氨芐抗性的LB 平板上篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)菌落PCR 鑒定陽(yáng)性克隆(圖略)。抽提重組克隆菌株質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ和SacⅡ酶切得到相應(yīng)大小片段(圖2)，驗(yàn)證 IDI1基因與載體相連，載體pYLIS-IDI1構(gòu)建成功。

2.2 tHMG1基因克隆和整合表達(dá)載體構(gòu)建

以釀酒酵母CEN.PK2-1C 基因組DNA 為模板，采用PCR 法擴(kuò)增tHMG1基因，擴(kuò)增出特異性條帶，大小約為1578 bp。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將序列正確PCR 產(chǎn)物經(jīng)SpeⅠ和BamHⅠ酶切并純化后，與經(jīng)相同酶切的載體pRS305-TEF1連接。在含有氨芐的LB 平板上篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)菌落PCR 鑒定陽(yáng)性克隆(圖略)。抽提重組質(zhì)粒經(jīng)SpeⅠ和BamHⅠ酶切得到相應(yīng)大小片段(圖3)，驗(yàn)證tHMG1基因與載體相連，載體pRS305-tHMG1構(gòu)建成功。

圖2 pYLIS-IDI1質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of plasmid pYLIS-IDI1 by enzyme digestion.M:DNA marker DL10000;1:pYLIS-IDI1 digested with NotⅠand SacⅡ.

圖3 pRS305-tHMG1質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.3 Identification of plasmid pRS305-tHMG1 by enzyme digestion.M:DNA marker DL10000;1:pRS305-tHMG1 digested with BamHⅠand SpeⅠ.

2.3 釀酒酵母工程菌株構(gòu)建

將整合表達(dá)質(zhì)粒pRS305-tHMG1導(dǎo)入釀酒酵母CEN.PK2-1C，成功構(gòu)建釀酒酵母tHMG1基因整合表達(dá)菌株LS01。將IDI1基因表達(dá)載體pYLIS-IDI1導(dǎo)入釀酒酵母CEN.PK2-1C 和LS01中，分別構(gòu)建工程菌株LS02和LS03。

2.4 調(diào)控類(lèi)異戊二烯合成途徑對(duì)麥角固醇含量的影響

麥角固醇是類(lèi)異戊二烯合成途徑終產(chǎn)物甾醇的主要前體，同時(shí)也是釀酒酵母細(xì)胞膜的重要組成部分。因此，類(lèi)異戊二烯合成途徑代謝流的變化可能會(huì)伴隨麥角固醇合成的增加或減弱，而麥角固醇含量微小變化能夠反應(yīng)代謝途徑上的重要改變[18]。通過(guò)測(cè)定釀酒酵母工程菌株麥角固醇含量(圖4)，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)兩基因后麥角固醇合成量從(14.26±1.11) mg/g DCW 增加至(17.68±1.44) mg/g DCW。結(jié)果表明，調(diào)控IDI1和tHMG1基因可以增加麥角固醇合成量。

圖4 調(diào)控類(lèi)異戊二烯合成途徑對(duì)麥角固醇含量的影響Fig.4 Effect on the content of ergosterol by regulating the isoprenoid pathway in S.cerevisiae.A:the control strain expressing the gene of AaLS1;B:the strain LS02 expressing the genes of AaLS1 and IDI1;C:the strain LS03 expressing the genes of AaLS1,IDI1 and tHMG1.

2.5 類(lèi)異戊二烯合成途徑的調(diào)控

為了進(jìn)一步提高芳樟醇產(chǎn)量，必須消除代謝途徑的限制因素，提高限制酶的表達(dá)水平。IDI1基因編碼類(lèi)異戊二烯基焦磷酸異構(gòu)酶，該酶參與可逆的異構(gòu)化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)IPP 與DMAPP 的相互轉(zhuǎn)化，是控制所有萜類(lèi)生物合成的第一步，調(diào)控該酶的表達(dá)水平對(duì)單萜化合物合成具有重要作用[19]。在釀酒酵母中，調(diào)節(jié)IDI1基因表達(dá)量，表達(dá)質(zhì)粒 pYLIS-IDI1，使芳樟醇含量提高了69.6%，達(dá)到(101.46±3.45)μg/L，單位細(xì)胞芳樟醇含量從8.61μg/g DCW 提高至15.24μg/g DCW。HMG-CoA 還原酶是類(lèi)異戊二烯合成途徑上的關(guān)鍵限速酶，它催化HMG-CoA 合成甲羥戊酸的反應(yīng)為不可逆的，其活性的不足會(huì)導(dǎo)致該途徑代謝通量降低。因此，我們進(jìn)一步提高HMG-CoA 還原酶水平，構(gòu)建tHMG1基因整合表達(dá)菌株，并在該菌株中表達(dá)質(zhì)粒pYLIS-IDI1，使芳樟醇產(chǎn)量提高至(127.71±7.68)μg/L，單位細(xì)胞芳樟醇含量提高9.4%，增加至16.66μg/g DCW (圖5)。通過(guò)對(duì)工程菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)tHMG1基因使菌體生長(zhǎng)有一定程度提高，可能由于代謝流增加對(duì)菌體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，表達(dá)IDI1基因后菌體生長(zhǎng)有減弱趨勢(shì)?？傮w來(lái)說(shuō)，在釀酒酵母工程菌合成芳樟醇過(guò)程中，產(chǎn)物芳樟醇未對(duì)菌株生長(zhǎng)造成致命影響(圖6)。

3 討論

在釀酒酵母工程菌株成功表達(dá)軟棗獼猴桃來(lái)源的芳樟醇合成酶基因的基礎(chǔ)上，本研究強(qiáng)化類(lèi)異戊二烯合成途徑，調(diào)控IDI1與tHMG1基因表達(dá)水平，使芳樟醇產(chǎn)量達(dá)到(127.71±7.68)μg/L，是Rico 等[11]報(bào)道在釀酒酵母工程菌中獲得的芳樟醇最高產(chǎn)量的3倍。

圖5 調(diào)控類(lèi)異戊二烯途徑芳樟醇產(chǎn)量和單位細(xì)胞芳樟醇含量Fig.5 Final concentrations of linalool and yields of linalool on biomass after regulating the isoprenoid pathway.A:the control strain LS04 expressing the gene of AaLS1;B:the strain LS02 expressing the genes of AaLS1 and IDI1;C:the strain LS03 expressing the genes of AaLS1,IDI1 and tHMG1.

圖6 釀酒酵母工程菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定Fig.6 Growth curves of engineered strains.() the control strain transformed with the empty vector of pY26-TEF1-GPD in CEN.PK2-1C;() the strain LS02 expressing the genes of AaLS1 and IDI1;() the strain LS03 expressing the genes of AaLS1,IDI1 and tHMG1;() the strain LS04 expressing the gene of AaLS1.

釀酒酵母能夠通過(guò)內(nèi)源類(lèi)異戊二烯合成途徑合成GPP，但是水平較低，限制了芳樟醇合成量，因此提高胞內(nèi)GPP 供給是增加芳樟醇產(chǎn)量的關(guān)鍵。對(duì) IDI1基因的調(diào)控能夠調(diào)節(jié) IPP/DMAPP 比例，將代謝流平衡轉(zhuǎn)向?qū)PP 生產(chǎn)有利的方向，進(jìn)而增加單萜物質(zhì)的合成[20]。過(guò)量表達(dá)IDI1基因后使芳樟醇產(chǎn)量從(59.84±4.05)μg/L提高至(101.46±3.45)μg/L。在類(lèi)異戊二烯合成途徑中，研究證實(shí)HMG-CoA 還原酶是關(guān)鍵限速酶，解除該酶的限制作用對(duì)促進(jìn)類(lèi)異戊二烯化合物積累起重要作用[21]。Verwaal 等[22]在釀酒酵母中過(guò)量表達(dá)該酶活性區(qū)域tHMG1基因使胡蘿卜素產(chǎn)量顯著提高。Rico 等[11]通過(guò)提高tHMG1基因表達(dá)水平，使芳樟醇產(chǎn)量從(21.92±1.75)μg/L提高至(30.19±3.88)μg/L。我們?cè)诟脑霫DI1基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步表達(dá)tHMG1基因，使芳樟醇產(chǎn)量提高1.3倍，達(dá)到(127.71±7.68)μg/L。

本研究通過(guò)調(diào)控類(lèi)異戊二烯合成途徑代謝流，提高GPP 合成前體供給，構(gòu)建芳樟醇高產(chǎn)的釀酒酵母工程菌。繼續(xù)對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，將獲得更高芳樟醇產(chǎn)量，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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