徐瑞敏，李運燕,2，段明明，劉 群,2，苑純秀，楊健美，馮新港

(1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室，上海 200241; 2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234）

日本血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴重的寄生蟲病，至今仍然嚴重影響我國人、畜的健康和經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展[1]。安全有效的疫苗的成功開發(fā)與應用是最終實現(xiàn)控制血吸蟲病目標的技術保障[2]。目前，公認的具有較高的保護性效果的疫苗是輻照致弱的尾蚴或童蟲疫苗RAV（radiation attenuated vaccine）[3]，但由于材料來源和安全性等問題，RAV仍未推廣應用。一般認為，通過模擬RAV的效應機制來開發(fā)血吸蟲疫苗可能是一條值得探索的新途徑。盡管對RAV誘導的宿主產(chǎn)生的高保護性免疫應答的機制有所了解，但RAV的蟲源性的分子基礎和機制仍然不明。據(jù)Hedstrom等[4]報道，SmHSP70為RA曼氏血吸蟲疫苗的一種重要的免疫原；Yang 等[5]通過應用蛋白質組技術分析發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較紫外致弱的日本血吸蟲尾蚴轉化來的童蟲的SjHSP70呈現(xiàn)高表達，他們研究小組進一步將含SjHSP70分子的DNA疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)可誘導小鼠產(chǎn)生偏向于Th1的免疫應答，且產(chǎn)生了一定的抗血吸蟲攻擊感染的免疫保護效果[6]。我們的前期的預實驗結果也顯示，SjHSP70在輻照日本血吸蟲尾蚴轉化來的童蟲（4 d和7 d）細胞表面呈高表達；另一個應急分子鈣網(wǎng)蛋白SjCRT在RA血吸蟲童蟲（7 d）來源細胞中也呈高表達，且可以刺激小鼠樹突細胞（DC）表型的成熟[7]。因此我們推斷:在RAV模型中，血吸蟲的應急分子如熱休克蛋白70（SjHSP70）、鈣網(wǎng)蛋白（SjCRT）以及高遷移蛋白1（SjHMGB1）等可能在活化宿主的抗原提呈細胞如DC、極化CD4+T細胞、以及增強RAV的免疫原性等方面發(fā)揮了重要的作用。

為實驗評價SjHSP70是否具有上述免疫生物學功能，必需獲得一定數(shù)量的蟲源的或是重組的SjHSP70蛋白。由于蟲體材料來源受到極大地限制，故一般采用原核或真核細胞表達系統(tǒng)來獲得目的蛋白。已報道的血吸蟲SjHSP70蛋白免疫學實驗使用的都是原核表達的重組蛋白，或直接使用DNA疫苗劑型[5]，考慮到原核表達重組蛋白可能帶來內毒素的污染，從而有可能影響對SjHSP70相關的免疫學功能的評價。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，在真核細胞Sf9中表達了SjHSP70，為進一步研究SjHSP70免疫學特征及其在RAV模型中所發(fā)揮的作用等提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體和細胞日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫、桿狀病毒轉移載體pFastBacHTA及其野生型毒株、Sf9 昆蟲細胞、DH10Bac 感受態(tài)細胞由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室保存；E.coliDH5α感受態(tài)細胞購自北京天根生物科技有限公司。

1.2 主要試劑ExTaq聚合酶、限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、DNA純化試劑盒及小型質粒抽提試劑盒均購自購自大連寶生物工程有限公司；DNA分子標準物購自北京天根生物科技有限公司；蛋白分子量標準物購自麥約爾生物技術有限公司；ODYSSEY anti-Mouse IRDye 800CW購自上海儀濤生物有限公司；Ni-NTA His-Bind 樹脂、Ni-NTA緩沖液試劑盒、昆蟲細胞裂解液購自Novagen公司；LipofectamineTM2000 脂質體轉染試劑、SF900 Ⅲ無血清培養(yǎng)基、FBS、Alexa Fluor@488 goat anti-mouse IgG（H+L）購自上海Invitrogen 公司；SjHSP70原核表達蛋白[8]及該蛋白免疫鼠源血清、血吸蟲感染鼠的陽性血清均由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所農業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室制備并保存。

1.3 引物設計與合成根據(jù)GenBank（登錄號:AY813185）的SjHSP70基因序列設計引物，PCR擴增該基因全長序列，其中:上游引物: 5'- CGGGATCCA TGTCTCGTAACTTGTTGTTA-3'; 下 游 引 物: 5'-CCGGAATTCTTACTGCTTCTC; CTGTTTAG -3'。上下游引物的5'端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶位點，引物由上海Invitrogen公司合成。以日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫為模板進行PCR 擴增，PCR 程序設定:94℃預變性5 min；94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存；將擴增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照DNA純化試劑盒操作進行產(chǎn)物純化回收。

1.4 pFastBacHTA-SjHSP70轉移載體的構建純化后的PCR 產(chǎn)物和pFastBacHTA載體用BamHⅠ和EcoRⅠ37℃雙酶切后分別純化回收，T4 DNA 連接酶、16℃恒溫水浴鍋過夜連接。將連接產(chǎn)物轉化到DH5α感受態(tài)細胞，涂板，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜，挑克隆過夜培養(yǎng)，取菌液進行PCR鑒定，陽性者再抽質粒進行雙酶切鑒定，并送至上海桑尼公司科技有限公司測序。陽性質粒命名為pFastBacHTA-SjHSP70。

1.5 重組穿梭質粒reBacmid-SjHSP70的構建和鑒定將重組的pFastBacHTA-SjHSP70質粒轉化到DH10Bac細胞，涂布于X-gal培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)24～48 h，通過藍白斑篩選出陽性克隆，經(jīng)SjHSP70特異性引物及Bac-To-Bac桿狀病毒載體通用引物[7]兩次PCR鑒定穿梭質粒reBacmid-SjHSP70。按照質粒抽提試劑盒操作手冊提取重組桿狀病毒穿梭載體reBacmid-SjHSP70。

1.6 reBacmid-SjHSP70轉染 Sf9昆蟲細胞將 2 μL重組質粒和 5 μL 脂質體分別加入 100 μL Grace's Insect培養(yǎng)基中稀釋混勻，室溫下孵育30 min。加入800 μL SF900 Ⅲ無血清培養(yǎng)基，混勻后轉染處于對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細胞，27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后，去除轉染液加入2 mL SF900 Ⅲ完全培養(yǎng)基（含10%FBS）。72 h后收集上清作為第1代重組病毒，經(jīng)3次傳代得到高效價的重組桿狀病毒為種毒株。

1.7 重組SjHSP70蛋白的檢測

1.7.1 間 接 免疫熒光（Indirect Immunofluorescent Assay，IFA）檢測 用上述重組桿狀病毒毒株于6孔細胞培養(yǎng)板中感染Sf9細胞48 h，-20℃甲醇固定20 min。以原核表達的SjHSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制備的血清一抗 37℃孵育 1 h ，PBST 洗滌 5 次，Alexa Fluor@488 goat anti-mouse IgG（H+L） 二 抗 孵 育45 min，PBST洗滌5次，熒光顯微鏡下觀察熒光反應。

1.7.2SjHSP70蛋白的純化及純化蛋白的Western blot分析 重組桿狀病毒毒株大量轉染Sf9細胞，48 h后收集細胞，263×g離心 10 min，取沉淀，加入昆蟲細胞裂解液，室溫裂解10 min，725×g離心10 min，取上清。按照Ni-NTA His-Bind純化操作手冊純化目的蛋白，將純化的SjHSP70重組蛋白SDSPAGE電泳,轉膜封閉過夜。以感染日本血吸蟲42 d的小鼠陽性血清作一抗，室溫孵育3 h，PBST洗滌5 次，ODYSSEY anti-Mouse IRDye 800CW 作二抗，室溫孵育45 min，PBST洗滌5次，雙色紅外激光成像儀成像。

2 結果

2.1 pFastBacHTA-SjHSP70轉移載體的構建以日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫為模板，PCR 擴增出一條大小約為1962 bp的目的條帶，與預期基因大小一致（圖1）；將其與pFastBacHTA載體連接轉化，經(jīng)菌液PCR、雙酶切（圖1）及測序簽定pFastBacHTA-SjHSP70重組載體構建成功。

圖1 SjHSP70基因的PCR擴增（A）和pFastBacHTASjHSP70轉移載體的構建及雙酶切鑒定Fig.1 The amplifi cation of SjHSP70 gene by PCR and the restriction enzyme analysis of recombinant transferring vector pFastBacHTA-SjHSP70

2.2 重組穿梭質粒 reBacmid-SjHSP70的構建將重組的pFastBacHTA-SjHSP70轉化至DH10Bac細胞，獲得重組穿梭質粒reBacmid-SjHSP70。以reBacmid-SjHSP70為模板，用SjHSP70基因特異性引物進行PCR，擴增產(chǎn)物大小約為1962 bp，用Bac-To-Bac桿狀病毒載體通用引物，擴增產(chǎn)物大小約為4392 bp，其中2430 bp為桿狀病毒序列（圖2），表明重組穿梭質粒構建成功。

圖2 重組穿梭質粒reBacmid-SjHSP70的PCR鑒定Fig.2 Identifi cation of recombinant bacubvirus reBacmid-SjHSP70 by PCR

2.3 間接免疫熒光（IFA）檢測SjHSP70蛋白在Sf9細胞中的表達用原核表達的SjHSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制備的血清做一抗，IFA檢測SjHSP70蛋白在Sf9細胞中的表達情況，結果表明，reBacmid-SjHSP70重組桿狀病毒感染的Sf9細胞能產(chǎn)生特異性的綠色熒光，而pFastBacHTA空載體感染Sf9細胞未出現(xiàn)熒光反應（圖3），說明SjHSP70蛋白在昆蟲細胞中表達。

圖3 IFA分析SjHSP70在Sf9細胞中表達（×200）Fig.3 The expression of SjHSP70 by IFA in Sf9 cells

2.4 SjHSP70蛋白的純化將His柱純化的SjHSP70重組蛋白SDS-PAGE電泳，可見一條大小約為72 kDa的單一條帶（圖4），分子量與預期大小相符。轉染12個75 cm2細胞培養(yǎng)瓶Sf9細胞可得到約800μg純度較高的蛋白。

圖4 SDS-PAGE電泳分析SjHSP70蛋白的純化Fig.4 Identifi cation of Purifi ed SjHSP70 protein by SDS-PAGE analysis

2.5 純化蛋白的Western blot分析純化的SjHSP70蛋白SDS-PAGE電泳，轉膜封閉。以感染日本血吸蟲42 d的小鼠陽性血清作一抗，Western blot結果顯示大小約為72 kDa的單一條帶（圖5），表明在Sf9細胞中表達的SjHSP70蛋白可被日本血吸蟲感染的鼠的陽性血清識別，具有較好的免疫原性。

圖5 Western blot分析SjHSP70蛋白的免疫原性Fig.5 Immunogenicity analysis of SjHSP70 by Western blot

3 討論

對細菌、真菌、原蟲和哺乳動物等物種的熱休克蛋白進行的大量研究顯示[9,10]，熱休克蛋白70（HSP70）是一類結構十分保守的分子，一般由3個功能上不同的結構域所構成，即N-端ATP酶結構域、肽結合結構以及C-端結構域[11]。HSP70具有多種生物學功能，除作為分子伴侶參加蛋白分子的折疊和去折疊功能外[11]，還具有激活先天免疫系統(tǒng)（包括巨噬細胞和淋巴細胞的活化以及樹突細胞的活化與成熟等）、參與抗原提呈和交叉提呈以及自身免疫和抗腫瘤免疫等功能[12]。特別是在各種應急條件（如環(huán)境的紫外輻照、病理的感染等）刺激下出現(xiàn)在胞外的HSP70分子，在活化先天免疫系統(tǒng)中起到十分重要的作用，HSP70分子既可以像“危險”信號一樣直接刺激先天免疫系統(tǒng)的細胞，又可以通過與其結合的所謂的“伴侶肽”形成的復合物來增強伴侶肽抗原被APC（如巨噬細胞和樹突狀細胞）的處理和提呈能力[13]。

日本血吸蟲的SjHSP70分子是否也具有活化宿主樹突細胞和增強其伴侶肽被DC處理及提呈的功能，從而在RA血吸蟲疫苗中發(fā)揮了重要作用，有待我們進一步驗證。據(jù)文獻報道，來源于細菌的脂多糖可通過TLR2或TLR4等信號受體介導的途徑激活宿主的DC形成Th1應答環(huán)境[14]，這與已報道的一些細菌和原蟲的HSP70誘生的免疫應答的功能和機制相類似[15]。因此，為排除脂多糖的干擾，最好采用真核表達的SjHSP70為材料來開展相關的工作。在本實驗中，我們采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)構建了含SjHSP70的真核表達載體，在昆蟲細胞Sf9中成功表達了SjHSP70分子。我們用分離純化的蛋白進行了Western blot分析，確定了表達的蛋白具有較好的抗原性。另外，我們發(fā)現(xiàn)，用該系統(tǒng)表達的目的蛋白經(jīng)純化后的得率相對較高，可以滿足后續(xù)實驗要求，而用該系統(tǒng)表達的蜱來源的某些蛋白的得率很低[16]，這可能與目的蛋白的理化特性有關。采用本實驗得到的重組SjHSP70刺激小鼠DC成熟的研究正在進行中。

總之，本研究在真核細胞Sf9中成功表達了SjHSP70，同時純化和鑒定了重組蛋白，為進一步研究SjHSP70活化宿主DC等免疫學功能提供了材料。

[1]Wang L D, Chen H G, Guo J G.A strategy to control transmission ofSchistosoma japonicumin China [J].The New England Journal of Medicine, 2009, 360(2)： 121-128.

[2]McManus D P, Loukas A.Current status of vaccines for schistosomiasis[J].Clin Microbiol Rev, 2008, 21(1)： 225-242.

[3]Wilson R A, Coulson P S.Immune effector mechanisms against schistosomiasis： looking for a chink in the parasite's armour[J].Trends Parasitol, 2009, 25(9)： 423-431.

[4]Hedstrom R, Culpepper J, Harrison R A,et al.A major immunogen inSchistosoma mansoniinfections is homologous to the heat-shock protein Hsp70[J].J Exp Med, 1987, 165(5)： 1430-1435.

[5]Yang L L, Lv Z Y, Hu S M,et al.Schistosoma japonicum：proteomics analysis of differentially expressed proteins from ultraviolet-attenuated cercariae compared to normal cercariae[J].Parasitol Res, 2009, 105(1)： 237-248.

[6]He S J, Yang L L, Lv Z Y,et al.Molecular and functional characterization of a mortalin-like protein fromSchistosoma japonicum(SjMLP/hsp70) as a member of the HSP70 family[J].Parasitol Res, 2010, 107(4)： 955-966.

[7]李瑩, 李運燕, 徐瑞敏, 等.日本血吸蟲鈣網(wǎng)織蛋白在Sf9昆蟲細胞中的表達及其活化樹突細胞的初步分析[J].中國動物傳染病學報, 2012, 20(4)： 45-51.

[8]何思杰, 楊琳琳, 呂志躍, 等.日本血吸蟲熱休克蛋白70（HSP70）的生物信息學分析及原核表達及純化[OL]：http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/200901-884/2009-01-19.

[9]Stewart G R, Young D B.Heat-shock proteins and the host-pathogen interaction during bacterial infection[J].Curr Opin Immunol, 2004, 16(4)： 506-510.

[10]Fumie A, Martha S, Rodriguez P,et al.Toxoplasma gondii-derived heat shock protein 70 stimulates maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells via toll-like receptor 4[J].Cell Stress & Chaperones,2006, 11(1)： 13-22.

[11]楊潔, 吳忠道.熱激蛋白70(HSP70)及血吸蟲HSP70研究進展[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志, 2011, 11(39)： 360-364.

[12]Bolhassani A, Rafati S.Heat-shock proteins as powerful weapons in vaccine development[J].Expert Rev Vaccines,2008, 7(8)： 1185-1199.

[13]Tobian A A, Canaday D H, Harding C V.Bacterial heat shock proteins enhance class II MHC antigen process and presentation of chaperoned peptides to CD4+T cells[J].Immunol, 2004, 173(8)： 5130-5137.

[14]劉中原, 李延平.細菌脂多糖的生物活性及作用機制[J].醫(yī)學綜述, 2010, 16(2)： 166-169.

[15]Uto T, Tsujimura K, Uchijima M,et al.A novel vaccine strategy to induce mycobacterial antigen-specific Th1 responses by utilizing the C-terminal domain of heat shock protein 70[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2011, 61(2)： 189-196.

[16]楊斯琦，周勇志, 張厚雙, 等.抗菌肽M50基因在Bac-To-Bac桿狀病毒系統(tǒng)中的表達[J].中國動物傳染病學報, 2010, 18( 5)： 49- 53.