曹宇凡，喬洪賓，劉萍萍，楊云霞，石耀軍，李 浩，劉金明，林矯矯，金亞美

(中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲重點實驗室，上海 200241)

血吸蟲?。⊿chistosomiasis）是一種分布廣泛、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，威脅亞洲、非洲及拉丁美洲的76個國家和地區(qū)，感染人數(shù)達兩億，是僅次于瘧疾的重要熱帶疾病[1,2]。目前吡喹酮是該病唯一高效的大規(guī)模治療藥物，但已有抗藥性的相關(guān)報道，并且藥物治療無法控制重復感染[3]，因此急需開發(fā)研制新的高效的疫苗和治療藥物。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，一些重組蛋白抗原，可以產(chǎn)生高達50%左右的減蟲率，說明血吸蟲疫苗的研制具有可行性[4,5]。

UDP-葡萄糖表異構(gòu)酶（GALE）在生物體中參與葡萄糖代謝的催化作用，是主要參與催化這一過程的三種酶之一（另兩種為半乳糖激酶，半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶）[6-8]，它催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之間的可逆反應(yīng)。GALE還參與細胞壁上多種糖化物的合成，如LPS、EPS等[9-11]。在果蠅和錐蟲等模式生物中，GALE蛋白對生長發(fā)育具有重要影響[12,13]；在人體內(nèi)，該蛋白的缺失引起代謝異常，導致半乳糖血癥[14]。曼氏血吸蟲和日本血吸蟲體內(nèi)也存在GALE蛋白[15,16]，本實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲GALE主要存在于蟲體表膜，這可能與血吸蟲通過皮膚轉(zhuǎn)化宿主能量有關(guān)[17]。

206佐劑（montanide ISA 206）是一種新型佐劑，乳化時不需添加其他乳化劑即可與水相穩(wěn)定結(jié)合，對硬件設(shè)備要求低，方便操作且對抗原的機械破壞小，故此類佐劑應(yīng)是未來佐劑的發(fā)展方向[18]。

本實驗室前期已經(jīng)就rSjGALE重組蛋白的免疫保護效果和類型經(jīng)行了評估，證實rSjGALE與弗氏佐劑聯(lián)合免疫能夠獲得良好的保護效果[17]。但由于弗氏佐劑對宿主有一定的損傷作用，易形成局部結(jié)節(jié)和無菌性膿腫[19]，為尋求更適宜的免疫保護方案，本研究著重評估rSjGALE重組蛋白與206佐劑聯(lián)合免疫的保護效果，為SjGALE的功能和實際應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料蟲株及實驗動物由中國大陸株日本血吸蟲尾蚴由上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點實驗室保存；6周齡 BALB/c小鼠（SPF級）購自中國科學院上海實驗動物中心。Agrose購自上海生工生物工程公司；Bacto-yeast extract、bactotryptone購自 OXOID 公司；Ni-NTA His Resin購自QIAGEN公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠 IgG 購自鼎國生物公司；HRP標記羊抗小鼠IgE購自AbD Serotec公司；206佐劑由SEPPIC公司提供。

1.2 rSjGALE重組蛋白的表達采用實驗室前期凍存表達菌種。前期構(gòu)建的pET-SjGALE質(zhì)粒，由SjGALE CDS基因全長序列（GenBank:AY815833，1056 bp）與 pET28b連接，并轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞[17]。

復蘇凍存菌種，于固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，37 ℃溫箱過夜。挑取數(shù)個陽性菌落小量表達，37 ℃培養(yǎng)，當 OD600達 0.4～0.6 時加入終濃度為 1 mmol/L IPTG誘導表達，收集菌體蛋白。SDS-PAGE分析，采用表達量最高的菌株大量表達，收集可溶性重組蛋白，并使用Ni-NTA His-Bind Resin參照說明書純化。

1.3 小鼠的免疫保護試驗6～8 w 齡雄性 BALB/c 小鼠隨機分成免疫組和對照組，每組10只。免疫組皮下注射 rSjGALE（50 μg）與206佐劑混合物，對照組皮下注射 PBS與206佐劑混合物。佐劑油相與水相的比例為54：46，冰浴超聲乳化，4℃靜置30 min不分層后使用。每隔2 w免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后14 d，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染40±2條日本血吸蟲尾蚴，攻蟲38 d后，剖殺小鼠，收集血清，以肝門靜脈灌注法收集蟲體并計數(shù)，收集肝臟并分別計算減蟲率和減卵率。重復試驗攻蟲后42 d剖殺。

1.4 免疫保護效果評估以肝門靜脈灌注法收集蟲體并計數(shù):

減蟲率=（1 -實驗組蟲體數(shù)目/對照組蟲體數(shù)目）×100%

蟲卵計數(shù):剖殺小鼠，取肝臟稱重，置于50 mL離心管內(nèi)加去離子水適量，勻漿機勻漿后定容至20 mL，取 1 mL 勻漿液和 10% NaOH 等體積混合，37 ℃消化約30 min，消化過程中不時混勻并少量取樣觀察，待消化完全后，光學顯微鏡下計數(shù)蟲卵，重復3次取平均值:

減卵率=（1-實驗組卵胚數(shù)目/對照組卵胚數(shù)目）×100%

蟲卵孵化:取4 mL勻漿液加入燒瓶中，加入去氯水至瓶頸上3～5 cm，液面上塞入薄層棉花（避免氣泡產(chǎn)生），棉花上方再輕輕加入適量去離子水，26～27℃孵化 2 h，將棉花上層 8 mL 液體轉(zhuǎn)移至 15 mL尖底離心管中，加入1～2滴碘酊固定染色毛蚴，4000×g 4℃離心 5 min，吸去大部分上清，剩余液體定容至2 mL，顯微鏡下計數(shù)毛蚴，重復3次取平均值:

孵化率 = 毛蚴總數(shù)/卵胚總數(shù)

減孵化率=（1-實驗組孵化率/對照組孵化率）×100%

1.5 特異性抗體水平檢測IgG檢測:于小鼠一免、二免、三免后的2 w收集血清，間接ELISA檢測各個時期IgG抗體水平。以純化的重組蛋白SjGALE （10 μg/ mL）包被96孔板，收集血清1：100稀釋后作為一抗，羊抗小鼠IgG（1：5000）為二抗，檢測抗體水平。IgE檢測:于小鼠一免、二免、三免后的d 10收集血清，利用間接ELISA的方法檢測各個時期IgE抗體效價。以純化的重組蛋白SjGALE （10μg/mL）包被96孔板，收集血清1：100稀釋后作為一抗，羊抗小鼠IgE（1：1000）為二抗，檢測抗體水平。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白rSjGALE原核表達純化及抗原性分析pET-SjGALE質(zhì)粒在大腸桿菌 BL21（DE3）中，加入IPTG終濃度 1 mmol/L誘導表達。SDS-PAGE分析顯示重組蛋白為40 kDa（圖1）。裂解液上清經(jīng)純化獲得較純的重組蛋白（圖2）。

圖1 pET-SjGALE在大腸桿菌BL21（DE3）中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of cell extracts and fractions from E.coli BL21(DE3)

圖2 純化的pET-SjGALE重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purifi ed recombinant protein pET-SjGALE

2.2 動物免疫保護試驗為了考察rSjGALE的免疫保護效果，對三免2 w后的小鼠進行攻擊感染，在攻蟲后38/42 d剖殺小鼠，利用肝門靜脈灌注的方法沖蟲并收集蟲體，統(tǒng)計蟲體數(shù)目，同時收集并處理小鼠肝臟，統(tǒng)計肝蟲卵數(shù)目，并孵化蟲卵、統(tǒng)計毛蚴孵出情況。第一次實驗中取得每只雌蟲對肝臟荷卵貢獻下降13.7%，毛蚴孵化減少49.01%；第二次實驗中肝臟荷卵減少51.5%。其余數(shù)據(jù) p-value 過高，組間差異度不夠，未參考（表1）。

表1 兩次免疫保護結(jié)果分析Table 1 Protective levels of BALB/c mice immunized with rSjGALE in two experiments

2.3 血清抗體水平IgG抗體水平檢測結(jié)果表明，實驗組與佐劑對照組相比，二免后抗體水平即大幅升高（圖3）。IgE抗體水平檢測結(jié)果表明，IgE水平在二免后也緩慢升高（圖4）。

圖3 rSjGALE蛋白免疫小鼠后特異性抗rSjGALE IgG抗體檢測Fig.3 Analysis of specifi c anti-rSjGALE IgG induced in mice immunized with rSjGALE

圖4 rSjGALE蛋白免疫小鼠后特異性抗rSjGALE IgE抗體檢測Fig.4 Analysis of specifi c anti-rSjGALE IgE induced in mice immunized with rSjGALE

3 討論

前期實驗結(jié)果表明，rSjGALE重組蛋白可以與抗日本血吸蟲全蟲抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的抗原性；以rSjGALE免疫小鼠所得血清也具有良好的反應(yīng)原性。rSjGALE與弗氏佐劑聯(lián)合免疫小鼠誘導產(chǎn)生了較好的免疫保護效果，尤其是對雌蟲產(chǎn)卵能力有一定抑制效果；對抗體水平和細胞因子的分析表明rSjGALE誘導宿主產(chǎn)生對寄生蟲病有保護作用的Th1型免疫反應(yīng)[17]。

根據(jù)UDP-葡萄糖表異構(gòu)酶在其他物種中的研究，我們認為SjGALE參與日本血吸蟲生長代謝過程，為血吸蟲的生長發(fā)育提供能量。前期研究表明SjGALE的表達在感染宿主23 d即開始排卵時達高峰[17]，可能與成熟雌蟲排卵時需要大量能量有關(guān)，這應(yīng)該與在免疫保護實驗中表現(xiàn)的導致雌蟲產(chǎn)卵能力下降有關(guān)系。

我們分析了rSjGALE與206佐劑聯(lián)合應(yīng)用后在減蟲率、減卵率、雌蟲對肝臟荷卵率的貢獻降低及減孵化率的情況。此次免疫保護單位肝臟減卵率達51.52%，和使用弗氏佐劑相當；每條雌蟲對肝臟荷卵的貢獻率降低13.7%，低于弗氏佐劑試驗結(jié)果的66.2%，59.5%[17]；我們還發(fā)現(xiàn)rSjGALE免疫動物體內(nèi)肝臟蟲卵的孵化率降低為49.01%，這方面的研究在弗氏佐劑實驗中未涉及?？贵w水平檢測發(fā)現(xiàn)，IgG水平自二免后顯著升高，IgE水平也緩慢升高。IgE水平對寄生蟲病的有保護性作用[20]，能夠激活巨噬細胞，誘發(fā)細胞毒反應(yīng)[21,22]。有實驗證明，血吸蟲感染42 d大鼠的血小板被動至正常同系受體，在攻擊感染的當日即導致高度的保護作用；但若血吸蟲感染42 d的大鼠血液經(jīng)IgE固相免疫吸附后，其促進正常血小板毒性的能力則消失[23]?，F(xiàn)已證明特異性IgE抗體與抗血吸蟲病再感染能力呈正相關(guān)[24,25]，因此在血吸蟲候選疫苗抗原的研究中，能否刺激機體產(chǎn)生IgE抗體是一個重要指標。本實驗中IgE二免后即與對照組產(chǎn)生顯著差異，這應(yīng)與rSjGALE提供的免疫保護有關(guān)。兩次實驗中蟲卵孵化率的差別，可能來源于攻蟲后剖殺天數(shù)的不同。血吸蟲蟲卵產(chǎn)出后還需約10 d左右才能成熟，所以42 d比38 d應(yīng)有更多成熟蟲卵，因此第二次實驗比第一次實驗蟲卵孵化率高。

日本血吸蟲雌蟲日產(chǎn)卵500～3500個，部分卵沉積在肝臟形成肉芽腫，嚴重破壞肝組織，是造成宿主病理損害的主要原因，蟲卵排出體外也是造成血吸蟲病傳播的主要根源。因此，減少產(chǎn)卵和降低蟲卵的孵化對血吸蟲病病理損害的減輕和傳播的阻斷具有重要意義[26]。rSjGALE不僅能夠明顯降低宿主肝臟中蟲卵數(shù)目，且降低蟲卵的孵化能力，可能在抗血吸蟲病傳播中發(fā)揮一定的作用。

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