單 瑋 闕華發(fā)

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科，上海，200032)

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)已成為一種遍布全球的多發(fā)病、常見(jiàn)病，在我國(guó)痛風(fēng)是僅次于糖尿病的代謝病，對(duì)患者的生命健康，生活質(zhì)量的危害較大［1－2］。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)根治痛風(fēng)的辦法?，F(xiàn)今治療痛風(fēng)的目的是控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作、降低血清尿酸水平，以預(yù)防尿酸鹽沉積導(dǎo)致的關(guān)節(jié)破壞及腎臟損害。對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的處理，西醫(yī)首選的藥物仍然是秋水仙堿與非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥，這兩類藥物具有起效快，療效顯著的特點(diǎn)，但其嚴(yán)重的毒副反應(yīng)限制了臨床運(yùn)用。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有臨床療效肯定，毒副反應(yīng)小，可以長(zhǎng)期服用的特點(diǎn)，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的防治方面具有西醫(yī)西藥不可替代的優(yōu)勢(shì)。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“濕熱痹”范疇，病機(jī)關(guān)鍵在于濕熱痹注，臨床治療采用清熱祛濕，解毒消腫，化瘀止痛為大法。金元時(shí)期的朱丹溪，創(chuàng)制上中下通用痛風(fēng)方，用蒼術(shù)、黃柏(二妙散)為基本組方治之，其治法對(duì)后世啟迪深遠(yuǎn)?，F(xiàn)代臨床多用二妙丸加川牛膝組成的三妙丸為基礎(chǔ)，治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎取得良好療效。為了探討三妙丸類方與引經(jīng)藥川牛膝在調(diào)控痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)理，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠70只，2月齡，體質(zhì)量180～220 g，平均(203.00±10.73)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(SCXK(滬)2007－0005)。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在18～28℃，相對(duì)濕度40%～70%的屏障系統(tǒng)喂養(yǎng)，正常飼料和飲水，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 中藥飲片:川牛膝、蒼術(shù)、黃柏，均由龍華醫(yī)院中藥房提供并制成水煎劑。其中二妙丸組由蒼術(shù)30 g、黃柏20 g組成，減壓濃縮至含生藥0.5 g/mL，人鼠等效劑量為4.41 g/kg;三妙丸低劑量組由蒼術(shù)30 g、黃柏20 g、川牛膝10 g組成，減壓濃縮至含生藥1.08 g/mL，人鼠等效劑量為5.29 g/kg;三妙丸高劑量組由蒼術(shù)30 g、黃柏20 g、川牛膝30 g組成，減壓濃縮至含生藥1.44 g/mL，人鼠等效劑量為7.05 g/kg;川牛膝低劑量組由川牛膝10 g組成，減壓濃縮至含生藥0.18 g/mL，人鼠等效劑量為0.89 g/kg;川牛膝高劑量組由川牛膝30 g組成，減壓濃縮至含生藥0.54 g/mL，人鼠等效劑量為2.64 g/kg。尿酸鈉結(jié)晶:美國(guó)Sigma－Aldrich 公司提供，批號(hào):BCBC2022。

1.2 方法

1.2.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型建立 參照文獻(xiàn)方法［3－4］，將1 g 尿酸鈉結(jié)晶加入40 mL 生理鹽水，再加10 mL 吐溫80，加溫?cái)嚢瑁瞥蓾舛葹?0 mg/mL的尿酸鈉溶液。用4.5號(hào)注射針在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)從45°方向插入右側(cè)脛骨肌鍵內(nèi)側(cè)，將50μL 尿酸鈉溶液注入到右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔，形成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。

1.2.2 動(dòng)物分組 70只大鼠隨機(jī)取10只作為正常組，其余60只大鼠建立模型后隨機(jī)分為模型組、二妙丸組、三妙丸低劑量組、三妙丸高劑量組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組，每組10只。

1.2.3 給藥方法 各組于造模后次日開(kāi)始給藥，正常組和模型組予生理鹽水灌胃每日1次，每次2 mL;各藥物干預(yù)組分別予相應(yīng)的中藥煎劑灌胃每日1次，每次2 mL。

2 觀察指標(biāo)

2.1 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度 用容積法測(cè)定大鼠踝關(guān)節(jié)的周徑［5］。試驗(yàn)前在每只大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)處作標(biāo)記，按容積法測(cè)定各鼠右側(cè)足踝容積2次，取2次的容積平均值作為各鼠造模前容積，確保各組數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后6 h、24 h、48 h、72 h用上述方法測(cè)量各組大鼠右足踝容積，取平均值作為記錄數(shù)據(jù)。

2.2 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織NF－κB P65 表達(dá)水平、TNF－α、IL－6、IL－8的水平 用藥3天后，各組大鼠以鹽酸氯胺酮(100 mg/Kg)麻醉，剪下大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)，取大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜組織，放入凍存管內(nèi)，分別粘貼標(biāo)記，用ELISA 法檢測(cè)TNF－α、IL－6、IL－8的水平，用Western blot 法檢測(cè)NF－κB P65 表達(dá)水平。

2.3 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織的形態(tài)學(xué)檢查 取大鼠滑膜組織放入清潔EP 管，10%福爾馬林浸泡，固定保存，作組織病理用。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織進(jìn)行鏡下組織形態(tài)學(xué)檢查，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)改良［6－7］。1)血管充血:正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分;2)炎細(xì)胞浸潤(rùn):正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分;3)滑膜腫脹:正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分;4)組織壞死:正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析和單因素方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD－T 檢驗(yàn)。

4 結(jié)果

4.1 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度 與正常組比較，模型組大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯高于正常組(P＜0.01)，說(shuō)明模型復(fù)制成功;造模后72 h，與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度低于模型組(P＜0.01，P＜0.05);其中，三妙丸高劑量組大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度低于二妙丸組、川牛膝組、三妙丸低劑量組(P＜0.01);二妙丸組大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度低于川牛膝組(P＜0.01)。造模后，除正常組大鼠外，其余各組大鼠出現(xiàn)明顯踝關(guān)節(jié)腫脹，于造模后6 h 出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，24 h 達(dá)到最高峰，48～72 h 有所減輕，見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠右踝關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定結(jié)果

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定結(jié)果

4.2 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜組織NF－κB P65 蛋白表達(dá)水平 與正常組比較，模型組NF－κB P65 表達(dá)水平明顯高于正常組(P＜0.01);與模型組比較，各藥物干預(yù)組NF－κB P65 表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01);其中三妙丸高劑量組NF－κB P65 表達(dá)水平低于二妙丸組、三妙丸低劑量組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);二妙丸組NF－κB P65 表達(dá)水平低于川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);川牛膝低劑量組與川牛膝高劑量組組間比較(P＞0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NF－κB P65 Western blot 法檢測(cè)結(jié)果

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織NF－κB P65 Western blot 法檢測(cè)結(jié)果

4.3 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF－α，IL－6，IL－8的水平 與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8水平明顯高于正常組(P＜0.01);各藥物干預(yù)組滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8水平低于模型組(P＜0.01);其中三妙丸高劑量組滑膜組織TNF－α 水平低于二妙丸組、三妙丸低劑量組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);三妙丸低劑量組與三妙丸高劑量組滑膜組織IL－6、IL－8水平低于二妙丸組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01)，三妙丸低劑量組與三妙丸高劑量組組間比較(P＞0.05);二妙丸組滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8水平低于川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);川牛膝低劑量組與川牛膝高劑量組組間比較(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8檢測(cè)結(jié)果

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)積分

4.4 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)形態(tài)組織病理學(xué)觀察:光鏡下觀察可見(jiàn)正?；す饣泄鉂?，半透明，滑膜由2～4 層上皮樣結(jié)締組織細(xì)胞構(gòu)成，無(wú)基膜，細(xì)胞間有少量結(jié)締組織和纖維，滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜細(xì)胞增生和毛細(xì)血管充血、水腫;模型組滑膜充血、水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增生;與正常組比較，模型組滑膜組織病理學(xué)積分高于正常組(P＜0.01);與模型組比較，各藥物干預(yù)組滑膜組織病理學(xué)積分低于模型組(P＜0.05);其中川牛膝高劑量組滑膜組織病理學(xué)積分低于二妙丸組、三妙丸組、川牛膝低劑量組(P＜0.05)，見(jiàn)表4、圖3、圖4、圖5。

圖3 正常組大鼠滑膜組織形態(tài)(×100)

圖4 模型組大鼠滑膜組織形態(tài)(×100)

圖5 川牛膝高劑量組大鼠滑膜組織形態(tài)(×100)

5 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“濕熱痹”范疇，其發(fā)病以脾腎兩虛為本，濕濁、痰瘀、熱毒為標(biāo)，屬正虛邪實(shí)之證［8－12］。病位屬下部，病機(jī)關(guān)鍵在于濕熱痹注。針對(duì)濕、熱、痹為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)鍵因素，臨床治療采用清熱祛濕，解毒消腫，化瘀止痛為法，常用清熱祛濕的三妙丸類方加減治療，取得顯著的療效。三妙丸出自明代虞摶所著的《醫(yī)學(xué)正傳》，是由《丹溪心法》二妙丸加牛膝而成。方中蒼術(shù)燥濕健脾、祛風(fēng)濕;黃柏清熱燥濕、瀉火解毒;牛膝活血通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利水通淋、引藥下行［13－15］;三藥合用，共奏清熱活血利濕之功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在模型建立后6h、24h、48h、72h，各藥物干預(yù)組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度均明顯低于模型組(P＜0.01 或P＜0.05)，說(shuō)明二妙丸、三妙丸、川牛膝具有降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的作用;其中三妙丸降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的療效尤為顯著，其理論基礎(chǔ)在于三妙丸是在二妙丸的基礎(chǔ)上加入川牛膝而成，川牛膝除了具有化瘀通絡(luò)、補(bǔ)益肝腎功效外，還有“引藥下行”的作用?！逗疁貤l辨》記載“牛膝，生用其性下走如奔，破血癥，通經(jīng)閉，引諸藥下行”;《本經(jīng)逢原》亦云“丹溪言牛膝能引諸藥下行，筋骨痛風(fēng)在下者宜之?！币虼?，在二妙丸中加入引經(jīng)藥川牛膝可以加強(qiáng)二妙丸的藥效。在抑制踝關(guān)節(jié)腫脹度方面，二妙丸與川牛膝具有藥效的協(xié)同及增效作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著三妙丸中牛膝劑量的增加，其抑制踝關(guān)節(jié)腫脹度的作用增強(qiáng)，具有一定的量效正相關(guān)關(guān)系。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作是尿酸鈉鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍結(jié)締組織以結(jié)晶形式沉積引起的急性炎癥反應(yīng)，是PMN 介導(dǎo)的炎癥。目前研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB 是急性炎癥反應(yīng)的中樞環(huán)節(jié)，NF－κB的不適當(dāng)激活是引起過(guò)度炎癥反應(yīng)和炎癥損傷的關(guān)鍵因素?；罨腘F－κB 可高效誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子，如TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。同時(shí)，對(duì)參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)(即級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng))的多種酶的基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8作為炎癥趨化因子和激活因子，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用［16］，它們與疾病的進(jìn)程及預(yù)后密切相關(guān)［17－18］。阻斷NF－κB 活性，從而下調(diào)眾多的炎性細(xì)胞因子表達(dá)成為目前預(yù)防、治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的希望和策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組NF－κB P65 表達(dá)水平明顯高于正常組，說(shuō)明大鼠致炎后在局部組織有高表達(dá)的NF－κB P65 存在，NF－κB P65 參與了炎癥反應(yīng);各藥物干預(yù)組NF－κB P65 表達(dá)水平低于模型組(P＜0.01)，說(shuō)明二妙丸、三妙丸、川牛膝通過(guò)下調(diào)NF－κB P65 表達(dá)水平，抑制NF－κB 活性，減輕局部炎癥，發(fā)揮抗炎作用。其中三妙丸下調(diào)NF－κB P65 表達(dá)水平尤為顯著，并且隨著三妙丸中牛膝劑量的增加，其下調(diào)NF－κB P65 表達(dá)水平的作用增強(qiáng)。三妙丸抗炎作用的增強(qiáng)，機(jī)制可能在于在二妙丸中加入牛膝后，增強(qiáng)了二妙丸的抑制NF－κB 活性的作用。通過(guò)對(duì)滑膜組織細(xì)胞因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二妙丸、三妙丸、川牛膝具有降低滑膜組織的IL－6、IL－8、TNF－α 水平的作用，并且隨著三妙丸中引經(jīng)藥川牛膝劑量的增加，其抑制細(xì)胞因子的作用增強(qiáng);說(shuō)明在引經(jīng)藥牛膝的協(xié)同作用下，可以加強(qiáng)二妙丸抑制細(xì)胞因子的作用。

尿酸鈉鹽沉積是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的特征性病理改變，病變主要發(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、關(guān)節(jié)周圍軟組織等部位?？梢钥吹交そM織炎細(xì)胞浸潤(rùn)，尿酸鈉鹽沉積、組織局部壞死，間質(zhì)膠原纖維樣變性，增生性變化，肉芽腫。本實(shí)驗(yàn)在光鏡下觀察到，正?；す饣泄鉂?，半透明，滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞增生和毛細(xì)血管充血、水腫;模型組滑膜充血、水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增生;二妙丸、三妙丸、川牛膝對(duì)滑膜炎癥反應(yīng)較模型組均有不同程度減輕，以川牛膝高劑量組改善滑膜組織病理?yè)p害的作用尤為明顯。其理論基礎(chǔ)可能與牛膝具有補(bǔ)益肝腎、活血痛經(jīng)的作用有關(guān)。

本研究結(jié)果為三妙丸類方及引經(jīng)藥川牛膝治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供了科學(xué)的依據(jù)，為中藥的引經(jīng)研究提供新思路，對(duì)開(kāi)發(fā)中藥靶向給藥體系奠定基礎(chǔ)。

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