李培真, 尚艷娥, 郭 健, 劉美辰

(國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,北京 100162)

嘔吐毒素(vomitoxin)又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),是一種單端孢霉烯族毒素,主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生.DON在體內(nèi)可能有一定的蓄積,但無特殊的靶器官,具有很強的細胞毒性,可導致動物腸功能紊亂,口腔黏膜和真皮損傷,免疫力下降[1].農(nóng)作物在生長、收割、儲存等環(huán)節(jié)水分含量偏高,就容易生成真菌毒素[2],根據(jù)王曉云等[3]在2005年調(diào)研發(fā)現(xiàn),嘔吐毒素對農(nóng)作物的污染呈現(xiàn)出高污染率、低污染程度的趨勢.目前比較常用的檢測技術(shù)主要是：薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)[4]及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]等.我國糧食收購時間集中、收購量大、工作條件簡單,而上述檢測方法均為實驗室操作,因此,尋求準確、快速、簡便的檢測方法對毒素進行定性、定量分析,是真菌毒素檢測研究的一個重要課題.

免疫膠體金層析快速診斷試紙條是20世紀90年代以來,在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù),該技術(shù)以其快速、準確且容易被基層掌握并大面積推廣的特點[6],在生物醫(yī)學各研究領(lǐng)域、微生物檢測、獸醫(yī)快速檢測以及食品安全檢測等方面得到了日益廣泛的應(yīng)用.嘔吐毒素定量快速檢測條是以膠體金層析式免疫競爭為原理,以小分子化合物為檢測對象[7-8],運用側(cè)流技術(shù),發(fā)展起來的一種真菌毒素快速檢測方法.

本課題對膠體金測試條法快速定量測定糧食中嘔吐毒素進行應(yīng)用性研究,評估該法的檢測限、定量限、線性范圍、準確性、重復性等參數(shù),以驗證此方法在檢測糧食中嘔吐毒素的適用性.

1 材料與方法

1.1 樣品來源

小麥粉7份,玉米5份,大米1份.兩份小麥陰性樣品,剩余11份樣品嘔吐毒素質(zhì)量分數(shù)為520～4 850μg/kg,共計13份樣品分別由國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心和美國Charm公司提供的有證參考物質(zhì).

1.2 材料與設(shè)備

嘔吐毒素試劑盒,包括嘔吐毒素定量檢測條,質(zhì)量分數(shù)為1 000μg/kg的嘔吐毒素陽性質(zhì)控,嘔吐毒素定量(deoxynivalenol quantitative,DONQ)稀釋緩沖液,快速一步分析(Rapid one step assay,ROSA)-M孵育器,ROSA-M讀數(shù)儀,以上均由美國Charm公司提供;KD10K型離心機,鹽城凱特實驗儀器設(shè)備有限公司;去離子水.

1.3 樣品處理與檢測方法

1.3.1 樣品處理方法

取樣品研磨成粉末使其通過20目篩,混勻樣品,取50 g樣品加入5倍的去離子水劇烈震蕩1～2 min,靜置1 min以獲得樣品提取物,如靜置效果不佳,可取1.0～1.5 mL提取物至離心管中,離心10 s,獲得上清液即為樣品提取物.移取100μL樣品提取物至分裝的1.0 mL DONQ稀釋緩沖液中,密閉混合和標記,即為稀釋提取物.

1.3.2 樣品檢測方法

逐一標記檢測條后,打開已升溫至45℃并恒溫的ROSA-M孵育器蓋子,將檢測條平底一側(cè)朝上放入ROSA-M孵育器,揭開檢測條粘膜至指示線處,使樣品槽暴露;移取300±15μL的稀釋提取物或質(zhì)控物至樣品槽,壓下粘膜重新密閉樣品槽,所有過程應(yīng)在1 min之內(nèi)完成;蓋上孵育器蓋子,孵育5 min,取出檢測條,2 min之內(nèi)使用ROSA-M讀數(shù)儀讀取結(jié)果.

1.3.3 陽性樣品定值濃度測定方法

所有樣品參考濃度測定方法均按照國家標準規(guī)定方法進行[9].

2 結(jié)果與討論

采用玉米、小麥、大米污染和無污染(陰性)樣品共13份測試,每份樣品按照1.3.1樣品處理和1.3.2檢測方法要求測定6次,每次測定雙平行樣,共計測定156次,記錄測試結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況.

2.1 檢測限和定量限測定結(jié)果

通過對兩份無污染(陰性)樣品的測定,共計得出24次陰性檢測數(shù)據(jù),對結(jié)果進行計算分析,檢測限(LOD)為測定平均值加3倍標準偏差,定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標準偏差.測試結(jié)果表明,嘔吐毒素的檢測限為118μg/kg,定量限為316μg/kg,完全滿足分析要求.

2.2 線性范圍測定結(jié)果

采用同一種樣品,以高效液相色譜法檢測結(jié)果為橫坐標,膠體金測試條法的檢測結(jié)果為縱坐標,計算線性范圍內(nèi)的相關(guān)性.小麥的線性范圍：500～5 000μg/kg(5點);回歸方程：y=1.04x-119;相關(guān)系數(shù)r為0.999 2,說明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好,線性關(guān)系圖見圖1.

圖1 小麥中嘔吐毒素兩種方法檢測值的線性關(guān)系Fig.1 Linear relationship between two methods for detecting value of vomintoxin in wheat

玉米的線性范圍：800～5 000μg/kg(5點);回歸方程：y=1.16x-5.49;相關(guān)系數(shù)R為0.998 7,說明在該濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好,線性關(guān)系見圖2.

圖2 玉米中嘔吐毒素兩種方法檢測值的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between two methods for detecting value of vomintoxin in corn

2.3 準確性測定結(jié)果

2.3.1 與標準方法參考值比較

使用膠體金測試條法與高效液相色譜標準方法分別對13組樣品中的11組陽性樣品進行檢測,采用配對t檢驗法比較兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異,具體見表1.

表1 嘔吐毒素兩種檢測方法配對t-檢驗結(jié)果分析Tab.1 Results analysis of paired t-test of two detection methods for vomintoxin

經(jīng)計算,tD=1.6,查t分布表,t0.05,10=2.23,tD=1.6＜t0.05,10=2.23,說明液相參考值與ROSA測試條法測定值之間無顯著差異,即兩種檢測方法的測定結(jié)果一致.

2.3.2 正確度測定結(jié)果

除去陰性樣品后的陽性樣品,以高效液相色譜法的測定結(jié)果作為認定值,將膠體金測試條法的測定結(jié)果與之比較,按正確度(%)=檢測值/認定值×100計算.11個樣品的正確度在90.3% ～133.9%,平均值為106%,正確度較好,具體見表2.

表2 嘔吐毒素兩種檢測方法正確度結(jié)果分析Tab.2 Results analysis of detecting accuracy of two methods for vomintoxin

2.4 重復性測定結(jié)果

每個樣品進行6次雙平行檢測,連續(xù)對13個樣品進行同樣的檢測,以此進行重復性驗證.對除去陰性樣品的11個陽性樣品進行檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計,根據(jù)統(tǒng)計,其變異系數(shù)范圍在4.7% ～19.6%,平均變異系數(shù)為11.8%,整體變異系數(shù)較小,具體數(shù)據(jù)見表3.

表3 嘔吐毒素膠體金測試條法重復性測定結(jié)果分析Tab.3 Results analysis of repeated measurement of colloidal gold strips method for vomintoxin

3 結(jié) 論

對膠體金測試條快速定量法檢測糧食中嘔吐毒素進行研究,通過簡單的樣品前處理,測試條點樣、孵育器孵育、讀數(shù)儀讀數(shù)這幾個步驟,15 min之內(nèi)就能完成一個樣品的測定,方法要求條件低、操作簡單.將測定值與液相色譜測得的定值比較,通過對檢測限、定量限、線性范圍、準確性、重復性等參數(shù)的統(tǒng)計分析,均能滿足糧食中嘔吐毒素測定的要求,易于推廣應(yīng)用.

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