鄧彥飛，劉真真，李云芳，劉慶友，羅 嬋，楊素芳，石德順

(廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530005)

水牛是我國(guó)南方重要的家畜品種之一，具有役用、肉用和奶用等多種用途．水牛低繁殖力、低產(chǎn)奶量一直是傳統(tǒng)方式進(jìn)行育種改良的難題，采用先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)有望提高水牛的生產(chǎn)性能．在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，選用合適的方法達(dá)到基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的第一步．常用的轉(zhuǎn)基因方法主要包括:氯化鈣法、脂質(zhì)體法、電轉(zhuǎn)染法和病毒載體法等［1］．目前，常用于運(yùn)載目的基因的病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和腺病毒載體．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法以其自身高效的轉(zhuǎn)基因效率，最早被用于基因治療、轉(zhuǎn)基因研究和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的研究中［2-3］．一些常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有pMSCV、pMIG、pMX 和pLXSN 等．

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)主要包括運(yùn)載外源基因的載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞的包裝蛋白(gagpol)和包膜質(zhì)粒攜帶包膜蛋白(env)［4］．病毒的包膜蛋白決定重組病毒的靶向性，包膜蛋白能否與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合，是病毒載體實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移成功與否的關(guān)鍵．不同物種或同一物種的不同類型細(xì)胞，因其細(xì)胞表面的受體不同，與不同逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)合能力也不相同．本研究選用2 種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝體系:一種是由小鼠胚胎干細(xì)胞病毒(Murine embryonic stem cell virus，M-ESV)改造而來(lái)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)pMSCV(pMSCV +PT67 包裝細(xì)胞系)，可以通過(guò)篩選穩(wěn)定的產(chǎn)毒細(xì)胞系生產(chǎn)重組病毒．另一種是由莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MLV)改造而來(lái)的pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)(pMX+包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG +Platinum-GP 包裝細(xì)胞系)，通過(guò)病毒包裝后由瞬時(shí)產(chǎn)毒細(xì)胞生產(chǎn)重組病毒．試驗(yàn)中，將攜帶EGFP 基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-EGFP 和pMSCV-EGFP，分別經(jīng)過(guò)病毒包裝后感染水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BFFs)，篩選出適用于BFFs的轉(zhuǎn)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)．在最適逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)下，探索能提高感染BFFs 效率的感染方式．本研究將為逆轉(zhuǎn)錄病毒法轉(zhuǎn)基因水牛的生產(chǎn)和水牛iPSC 的研究提供技術(shù)依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 主要材料與試劑

3～5月齡水牛胎兒取自南寧市屠宰場(chǎng)，pMSCV和pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、PT67/Platinum-GP 包裝細(xì)胞由廣西大學(xué)鄭喜邦老師惠贈(zèng)，NIH3T3 細(xì)胞和293細(xì)胞由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，pEGFP-C1 由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM高糖基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(GIBCO)，青霉素、鏈霉素(雙抗，100×，GIBCO)，胎牛血清(FBS，Hyclone)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(LTX，Invitrogen)，G418、促感染劑Polybrene(Sigma)，胰酶(Sigma)，pMD18-T 克隆載體、Taq 酶、內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ)和T4 連接酶(TaKaRa)，質(zhì)粒去內(nèi)毒提取試劑盒(QIAGEN)，倒置顯微鏡(Nikon)，活細(xì)胞工作站熒光檢測(cè)(Nikon Ti)，0.22 和0.45 μm 濾器(Millipore)，引物合成和序列測(cè)定(上海生工生物工程有限公司)．

1．2 表達(dá)載體構(gòu)建

以pEGFP-C1 載體為模版，采用帶有EcoRⅠ(上游)和Xho Ⅰ(下游)酶切位點(diǎn)的特異性引物(EGFP5'-GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG，EGFP3'-CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG)擴(kuò)增EGFP 基因的編碼區(qū)，連接到pMD18-T 上，構(gòu)成pMD18T-EGFP 載體．采用EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切pMD18T-EGFP、pMSCV 和pMX 質(zhì)粒．將酶切獲取的EGFP、pMSCV 和pMX 分別經(jīng)過(guò)膠回收之后，采用T4 連接酶，將EGFP 分別連接到pMSCV 和pMX 上，最終獲取能表達(dá)EGFP 的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCVEGFP 和pMX-EGFP．

1．3 細(xì)胞培養(yǎng)

水牛胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):取水牛胎兒耳部的皮膚組織，PBS 洗3 次，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒30 s，再用PBS 洗3 次，將組織塊放入1.5 mL 的EP 管中，剪碎，用PBS 沖洗到50 mL 的離心管中，加入5～10 mL 胰酶(2.5 mg/mL)，37 ℃條件消化10～15 min(每隔3～5 min 用移液管吹打10 下)，加入30 mL 左右的DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM+體積分?jǐn)?shù)10% FBS)，混勻之后接種到10 cm 培養(yǎng)皿，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱，每隔3～4 d 換液1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右匯合度時(shí)，胰酶消化傳代或者液氮凍存?zhèn)溆茫甈T67 和Platinum-GP 病毒包裝細(xì)胞系、NIH3T3 和293 病毒滴度測(cè)定細(xì)胞系均采用DMEM+體積分?jǐn)?shù)10%FBS 培養(yǎng)，胰酶消化法傳代，液氮保存?zhèn)溆茫?/p>

1．4 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝

pMSCV-EGFP 穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞系的篩選:將PT67細(xì)胞接種到60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿里，待細(xì)胞到60%～70%的匯合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染．轉(zhuǎn)染前2 h 將培養(yǎng)基改換無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM(雙無(wú)DMEM)3 mL．采用脂質(zhì)體LTX + Plus 法進(jìn)行轉(zhuǎn)染:取1 mL 雙無(wú)DMEM，加入pMSCV-EGFP 質(zhì)粒9 μg 和Plus 9 μL，混勻，室溫孵育5 min;加入LTX 12 μL，混勻，室溫孵育30 min 后，均勻滴加到PT67 細(xì)胞培養(yǎng)基中;5 h 后改換DMEM 完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h 收集病毒上清液，0.45 μm 的濾器過(guò)濾備用．若需要建立穩(wěn)定的產(chǎn)毒細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后48 h 傳代，在培養(yǎng)基中添加600 μg/mL 的G418 進(jìn)行篩選，每隔3 d 換液，篩選21 d后克隆形成，熒光顯微鏡下通過(guò)EGFP 表達(dá)挑選克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后將細(xì)胞凍存．將細(xì)胞復(fù)蘇后48 h 收集病毒上清液，過(guò)濾備用．

pMX-EGFP 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝:將Platinum-GP包裝細(xì)胞接種到60 mm 培養(yǎng)皿里．轉(zhuǎn)染步驟同使用脂質(zhì)體LTX 的轉(zhuǎn)染方法．其中采用pMX-EGFP 和包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG(水泡口炎病毒包膜蛋白)共轉(zhuǎn)Platinum-GP 包裝細(xì)胞，按照6 μg pMSCV-EGFP 質(zhì)粒+3 μg pCMV-VSVG(質(zhì)量比為2∶1)的量進(jìn)行．轉(zhuǎn)染48 h 后，即可收集病毒上清液，0.45 μm 的濾器過(guò)濾備用．

1．5 逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃縮

本試驗(yàn)采用超速離心的方法對(duì)病毒進(jìn)行濃縮．由于pMSCV 和pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)所使用的包膜蛋白不同(分別是10A1 和VSV-G)，在超速離心力的作用下不會(huì)對(duì)VSV-G 所包裝出的病毒顆粒造成破損［5］．因此，本試驗(yàn)僅對(duì)pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)所產(chǎn)生的病毒上清液進(jìn)行超速離心濃縮．超速離心的參數(shù)是:12 000 r/min，4 ℃，120 min．離心后，去掉上清液，加入PBS 重懸底部的病毒顆粒，分裝備用．

1．6 病毒滴度測(cè)定

采用經(jīng)典的LaSRT 病毒滴度測(cè)定法，通過(guò)EGFP標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量計(jì)算滴度．pMSCV-EGFP 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定:在滴度測(cè)定前20 h 左右，接種NIH3T3 細(xì)胞于96 孔板，每9 個(gè)孔為1 組．添加病毒上清液前，換成體積分?jǐn)?shù)為2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基90 μL，在第1 個(gè)孔加入10 μL 新鮮病毒上清液(病毒包裝48 h 后直接收集的病毒上清液)，以后每個(gè)孔按體積比10∶1 倍比稀釋．感染48 h 后，熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)EGFP 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以無(wú)EGFP 表達(dá)的前一個(gè)孔作為計(jì)量孔．計(jì)量孔EGFP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)記為m，按照以下公式計(jì)算病毒的滴度:病毒滴度=m×(計(jì)量孔相對(duì)于第1 孔的稀釋倍數(shù)×1 IU)/第1孔加入病毒上清液的體積．新鮮病毒上清液和超速離心濃縮后的pMX-EGFP 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定:滴度測(cè)定步驟與pMSCV-EGFP 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定相同，用于滴度測(cè)定的細(xì)胞為293 細(xì)胞．

1．7 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BFFs

將BFFs 復(fù)蘇后，傳至第3～5 代，感染時(shí)的細(xì)胞匯合度為70% 左右，感染時(shí)添加病毒的感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)為30～40，同時(shí)添加6 μg/mL Polybrene 促進(jìn)感染．感染BFFs 時(shí)分別按照以下幾種方式進(jìn)行:①pMSCV 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染BFFs 1 次，感染24 h;②pMSCV 穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞系的病毒上清液感染BFFs 2 次，每次感染12 h;③pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染BFFs 1 次，感染24 h;④pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染BFFs 2 次，每次感染12 h;⑤超速離心后的pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BFFs 1 次，感染24 h．感染24 h 后，改換為DMEM 完全培養(yǎng)基，72 h后在活細(xì)胞工作站熒光檢測(cè)EGFP 的表達(dá)情況．

2 結(jié)果與分析

2．1 構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體

pMSCV-EGFP 和pMX-EGFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程見圖1 和圖2．

圖1 pMSCV-EGFP 逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體構(gòu)建Fig．1 The construction of pMSCV-EGFP retrovirus vector

圖2 pMX-EGFP 逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體的構(gòu)建Fig．2 The construction of pMX-EGFP retrovirus vector

PCR 擴(kuò)增得到EGFP 的長(zhǎng)度為0.72 kb(圖1－泳道2)，將EGFP 連接到pMD18-T 載體上(圖1－泳道3)，經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，T4 連接酶連接到經(jīng)過(guò)相同雙酶切的pMSCV 和pMX 載體上，組建pMSCV-EGFP 和pMX-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒(圖1－泳道5 和圖2－泳道1、泳道2)．采用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)2 個(gè)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后可以看到明顯的目的條帶(圖1－泳道6 和圖2－泳道3)．

2．2 病毒的包裝和陽(yáng)性產(chǎn)毒細(xì)胞株的篩選

將pMSCV-EGFP 轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞PT67，48 h 后在熒光顯微鏡下可以觀察到EGFP 的表達(dá)(圖3A)．將細(xì)胞分盤培養(yǎng)后，添加600 μg/mL 的G418 進(jìn)行篩選，獲得能穩(wěn)定生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒并表達(dá)EGFP 細(xì)胞株(圖3B)．同樣，pMX-EGFP 結(jié)合pCMV-VSVG 共轉(zhuǎn)platinum-GP 細(xì)胞，48 h 后同樣能檢測(cè)到EGFP 的表達(dá)(圖3C)．

圖3 病毒包裝和產(chǎn)毒細(xì)胞系的熒光檢測(cè)Fig．3 EGFP expression in the packaging cells after virus packaging

2．3 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度

采用NIH3T3 細(xì)胞和293 細(xì)胞分別對(duì)2 種逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度進(jìn)行檢測(cè)．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pMSCV 和pMX逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包裝出來(lái)的病毒滴度都可達(dá)106;pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)所包裝的病毒經(jīng)過(guò)超速離心濃縮后可達(dá)107(圖4)．

圖4 不同逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度測(cè)定Fig．4 Virus titer test of different retroviruses

2．4 不同逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)感染BFFs

篩選能有效感染BFFs 的不同逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)和最佳感染方式，熒光顯微鏡下觀察BFFs 中EGFP的表達(dá)情況．結(jié)果表明:采用pMSCV-EGFP 病毒上清液感染BFFs 1 次或者2 次，熒光視野下只有少量的BFFs 表達(dá)EGFP，尤其是1 次感染組只有零星的細(xì)胞表達(dá)EGFP(如圖5A、5B);而采用pMX-EGFP 病毒上清液感染BFFs 1 次后可以看到大部分細(xì)胞呈EGFP 陽(yáng)性(如圖5C)，當(dāng)采用2 次感染的方式或者超速離心濃縮后感染BFFs 1 次可以顯著地提高感染效率(圖5D、5E)．因此，pMX 系統(tǒng)比pMSCV 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)更適合于感染BFFs，能有效地實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)．同時(shí)，增加病毒的感染次數(shù)和提高病毒的滴度可以顯著提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BFFs 的效率．

圖5 2 種逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BFFs 后熒光檢測(cè)Fig．5 EGFP expression in BFFs after retrovirus infection

3 討論

本研究主要探索能高效實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移并在BFFs中表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)．構(gòu)建能表達(dá)綠色熒光蛋白的pMSCV-EGFP 和pMX-EGFP 2 種逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)各自的病毒包裝體系生產(chǎn)重組病毒，感染BFFs，通過(guò)EGFP 在BFFs 中的表達(dá)情況，確定能高效感染BFFs 的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)．同時(shí)，采用病毒1 次感染、2 次感染和超速離心濃縮后感染等3種方式感染BFFs，探討能高效感染BFFs 的最佳感染方式．結(jié)果表明:pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)感染BFFs 的效率高于pMSCV 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng);pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒2 次感染或者超速離心后感染的方式能更有效地感染BFFs．

目前，容易被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶細(xì)胞主要是人和小鼠的細(xì)胞，病毒法在人和小鼠細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因操作中應(yīng)用最多［6］．由于物種間和細(xì)胞間的差異，其他物種的體細(xì)胞能否通過(guò)合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，有待進(jìn)一步探索．這主要是因?yàn)椴煌亟M逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的假病毒在感染體細(xì)胞時(shí)具有靶向性，感染不同靶細(xì)胞的效率不同．逆轉(zhuǎn)錄病毒在攜帶目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)表達(dá)的過(guò)程中，受到諸多因素的影響，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)、包裝細(xì)胞包裝病毒的穩(wěn)定性、包膜蛋白的靶向性、靶細(xì)胞表面的受體和靶細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)等［7］．本研究所使用2 種經(jīng)典的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)中，pMSCV 的包裝細(xì)胞為經(jīng)過(guò)NIH3T3 改造而來(lái)的PT67 細(xì)胞，整合了病毒包裝所需的gag-pol 和包膜蛋白10A1［8］;pMX 的包裝細(xì)胞為經(jīng)過(guò)293 細(xì)胞改造而來(lái)的Platinum-GP 細(xì)胞，整合了gag-pol，而包膜蛋白需要另外的包裝質(zhì)粒(本試驗(yàn)使用pCMV-VSVG)提供［7］．結(jié)果表明，pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)所包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BFFs 的效率顯著高于pMSCV 系統(tǒng)．除了BFFs 不易被感染之外［9］，不同包裝系統(tǒng)本身的組成也會(huì)影響感染效率:如pMX 載體骨架本身表達(dá)外源基因的能力高于pMSCV;pMSCV 所使用的包裝細(xì)胞PT67 整合了全部逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝所需的元件，長(zhǎng)期的體外擴(kuò)增可能會(huì)導(dǎo)致某個(gè)元件丟失或者重組，影響包裝病毒的能力;2 個(gè)包裝系統(tǒng)所使用的包膜蛋白不同，VSV-G 包裝出的病毒為泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Pantropic retrovius)，能感染的靶細(xì)胞范圍較廣，而10A1 所包裝出的病毒為兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Amphotropic retrovius)，感染靶細(xì)胞的范圍相對(duì)較窄;與之對(duì)應(yīng)的是，水牛體細(xì)胞上所存在的能結(jié)合不同病毒的受體和受體的量也會(huì)影響感染效率［6］．

在找到能感染BFFs 的合適逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)之后，病毒的滴度和不同的感染方式也會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率．一個(gè)細(xì)胞所接觸的病毒顆粒的數(shù)量，即感染復(fù)數(shù)的大小，是決定病毒能否結(jié)合靶細(xì)胞的重要因素．通常采用對(duì)病毒進(jìn)行超速離心濃縮，或者增加感染次數(shù)來(lái)提高病毒的滴度和感染復(fù)數(shù)［10］．本研究對(duì)pMX 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)包裝的病毒進(jìn)行超速離心后感染BFFs 1 次，或者使用新鮮病毒感染BFFs 2 次，都能更有效地感染BFFs．這說(shuō)明，對(duì)于一些不易被感染的細(xì)胞，可以通過(guò)提高病毒的滴度和增加感染次數(shù)來(lái)提高感染效率．同時(shí)，本試驗(yàn)中也添加了促感染試劑Polybrene 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，消除細(xì)胞和病毒顆粒之間的電荷排斥，促進(jìn)感染效率．

值得說(shuō)明的是，在同樣的病毒滴度和感染方式下，pMSCV 系統(tǒng)不易感染BFFs，在熒光顯微鏡下只有零星的幾個(gè)細(xì)胞表達(dá)EGFP．通過(guò)熒光顯微鏡就能準(zhǔn)確地判斷pMX 系統(tǒng)感染BFFs 的效率顯著高于pMSCV 系統(tǒng)，因此，本試驗(yàn)沒有采用流式細(xì)胞技術(shù)等統(tǒng)計(jì)感染效率．對(duì)適合于水牛體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因操作的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)進(jìn)行探索，可以為轉(zhuǎn)基因水牛生產(chǎn)和水牛iPSCs 生產(chǎn)等提供研究基礎(chǔ)．

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