劉 凱，梁俊玉，肖 引，陳 江，陳 芳

杏仁是薔薇科李屬植物杏或山杏的種子，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、胡蘿卜素、B 族維生素、維生素C、維生素P，以及鈣、磷、鐵、硒等營養(yǎng)成分。杏仁蛋白質(zhì)含人體所需的18 種氨基酸，且氨基酸組成比例平衡［1］。杏仁蛋白以易消化的低分子白蛋白為主，占總蛋白量的80%以上，其消化率高于一般的動物蛋白，是真正的優(yōu)質(zhì)植物蛋白。杏仁中的蛋白質(zhì)不僅是很好的營養(yǎng)來源，也是藥食兼用的蛋白質(zhì)，利用杏仁提取的蛋白質(zhì)可以緩解蛋白質(zhì)的資源短缺［2］。我國杏仁產(chǎn)量雖然很大，但是杏仁的利用和深加工還未受到重視，杏仁產(chǎn)品仍然以杏仁油、杏仁露及杏仁罐頭為主［3］。

從杏仁中提取蛋白質(zhì)，經(jīng)干燥制成蛋白粉，可以作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑及食品添加劑。目前，杏仁蛋白質(zhì)提取方法主要有堿溶酸沉法［4］、酶法提?。?］、反膠束法提取［6］、冷榨法提取［7］。上述提取方法的工藝過程相對繁瑣耗時(shí)，且成本較高。另外，堿性條件對蛋白質(zhì)有破壞作用，并可使蛋白部分分解。因此，用鹽法提取蛋白質(zhì)純度要高于堿法提取，而用磷酸鹽法提取蛋白質(zhì)簡單易行，且無食品安全隱患。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用磷酸鹽法提取杏仁渣中的蛋白質(zhì)，為杏仁的深加工及綜合利用研究提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 原材料 杏仁渣(購于西安萬壽路中藥材市場)。

1.2 試劑 牛血清白蛋白(Bio Basic 公司，純度98%)、K2SO4、H2SO4、NaOH、HCl、CuSO4、H2O2、無水乙醇、磷酸、考馬斯亮藍(lán)G－250、NaHCO3、NaH2PO4、枸櫞酸(以上均為分析純)。

1.3 主要儀器 電動攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司):TBL5M 臺式超大容量冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 杏仁渣中總蛋白的測定 采用凱氏定氮法測定杏仁渣中總蛋白含量［8］。

2.2 杏仁蛋白的制備 壓榨油后的杏仁渣→粉碎(過40 目篩)→加入磷酸鹽水浴加熱攪拌→離心15 min→靜置除去油層和下層沉淀→濾液調(diào)酸堿度至等電點(diǎn)→過濾→干燥。蛋白質(zhì)提取率的測定:以考馬斯亮藍(lán)G250 染色法測定提取液中蛋白質(zhì)的含量［9］。

本研究樣品中粗蛋白的百分含量平均值為45.72%。

2.3 牛血清標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白50.00 mg，用少量蒸餾水溶解，定容至500 ml。此即為100 μg/ml 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。精密稱取考馬斯亮藍(lán)G－250 50.00 mg，加入95%乙醇25 ml，再加入85 ℅(W/V)H3PO450 ml，最后用蒸餾水定容至500 ml。以蛋白質(zhì)含量(X)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)作圖，并對結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析。本研究中，得到線性回歸方程為:Y=8.8970X+0.0180，r=0.9994。

2.4 杏仁渣中蛋白的提取工藝

2.4.1 單因素變化對杏仁蛋白提取效果的影響實(shí)驗(yàn)前初步確定提取條件為料液比1∶30，溫度40℃，時(shí)間1.0 h，鹽濃度為0.02 mol/L。

2.4.1.1 時(shí)間 準(zhǔn)確稱量4.000 g 已粉碎樣品，在料液比為1∶30，溫度40 ℃，鹽濃度0.03 mol/L 對杏仁渣分別攪拌浸提0.5、1.0、1.5、2.0 h ，溶解后于離心機(jī)中以4000 r/min 離心15 min。去掉油層和沉淀，取清液125 μl，加入25 ml 容量瓶定容，取定容液1 ml，加考馬斯亮藍(lán)G－250 溶液5 ml，利用考馬斯亮藍(lán)G－250 染色法在595 nm 波長下比色。以蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，繪制時(shí)間與提取率的關(guān)系曲線。由表1 可知，杏仁渣用磷酸鹽浸提所得的蛋白提取率隨著時(shí)間增加到一定程度時(shí)不再增加。

表1 磷酸鹽法杏仁渣蛋白質(zhì)提取時(shí)間、吸光度與提取率的關(guān)系

2.4.1.2 料液比 準(zhǔn)確稱量4.000 g 已粉碎樣品，在溫度40 ℃，鹽濃度0.03 mol/L，料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 的條件下攪拌浸提1.0 h，其余同法測定。結(jié)果表明，隨料液比的增大，蛋白質(zhì)的提取率也在增大，當(dāng)料液比到1∶30 時(shí)蛋白不再溶解，提取率基本不再增高(表2)。

表2 磷酸鹽法杏仁渣蛋白質(zhì)提取料液比、吸光度與提取率的關(guān)系

2.4.1.3 溫度 準(zhǔn)確稱量4.000 g 已粉碎樣品，在料液比為1∶30，鹽濃度為0.03 mol/L，溫度分別為30、40、50、60 ℃的條件下攪拌提取1.0 h，其余同法測定。結(jié)果表明，隨著溫度的增大，杏仁蛋白的提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，50 ℃時(shí)蛋白提取率最高(表3)。

表3 磷酸鹽法杏仁渣蛋白質(zhì)提取溫度、吸光度與提取率的關(guān)系

2.4.1.4 鹽濃度 本實(shí)驗(yàn)選用的鹽為NaHCO3和NaH2PO4，二者之間的濃度比例為1∶1。準(zhǔn)確稱量4.000 g 已粉碎樣品，在料液比為1∶30，溫度為40℃，鹽濃度分別為0. 005、0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0.05 mol/L 的條件下攪拌提取1.0 h，其余同法測定。結(jié)果顯示，磷酸鹽濃度對杏仁蛋白質(zhì)提取率的影響明顯，蛋白質(zhì)提取率隨鹽濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在0.01 mol/L 時(shí)最大(表4)。

表4 磷酸鹽法杏仁渣蛋白質(zhì)提取鹽酸濃度、吸光度與提取率的關(guān)系

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案(表5)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四個(gè)因素的影響程度為D ＞C ＞B ＞A，其中鹽濃度具有顯著性影響。根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果確定提取方案為A3B2C3D2，提取率為75% (表6，7)。從經(jīng)濟(jì)性考慮，將溫度設(shè)定為50 ℃，提取時(shí)間為1.0 h，料液比1∶30，其他條件不變，進(jìn)行提取率實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)提取率為 72%，與 A3B2C3D2方案接近，故采用A2B1C2D2為最優(yōu)方案。

表5 磷酸鹽法提取杏仁蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

表6 磷酸鹽法提取杏仁蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 磷酸鹽法提取杏仁蛋白正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，得到了各因素的最佳范圍。考慮各方面，最終確定最佳因素為提取溫度50 ℃，料液比1∶30，提取1.0 h，鹽濃度為0.01 mol/L，作為提取蛋白產(chǎn)品的最優(yōu)工藝條件，可使蛋白質(zhì)提取率達(dá)到72%，為杏仁蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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