馮成亞，高潔瑩，甄乾娜，樊子勉，朱明松，楊香春，丁敏*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌內(nèi)科，重慶 400016)

色氨酸(tryptophan，Trp)作為人體內(nèi)的一種必需氨基酸，不僅可合成蛋白質(zhì)，還能在不同組織中代謝為多種生物活性分子。在腦中Trp 主要通過色氨酸羥化酶(TPH)的作用生成5-羥色胺，5-羥色胺在單胺氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid，5-Hiaa);在腦外Trp 主要經(jīng)色氨酸-2，3-雙加氧酶(TDO)或吲哚胺-2，3-雙加氧酶(IDO)的作用生成甲酰犬尿氨酸，甲酰犬尿氨酸經(jīng)犬尿氨酸甲酰胺酶代謝為犬尿氨酸(kynurenine，Kyn)，Kyn 通過犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用代謝為犬尿喹啉酸(kynurenic acid，Kyna)［1］。腫瘤、腎衰竭、感染性疾病、神經(jīng)性疾病等均存在色氨酸代謝紊亂［2-7］。Kyn/Trp 可間接反映IDO 活性和細胞免疫狀態(tài)［8］。色氨酸及其代謝物的分析方法常用高效液相色譜法(HPLC):其中Trp和Kyn 采用紫外檢測［9-12］，Kyna 采用熒光檢測［13，14］，而5-Hiaa則用熒光或電化學(xué)檢測［15-17］。目前尚未檢索到同時測定血漿Trp、Kyn、Kyna和5-Hiaa的方法。本研究采用醋酸鋅在線衍生及程序波長的高效液相色譜技術(shù)同時分離和測定Trp 及其3種代謝物，利用3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-N-Tyr)為內(nèi)標(biāo)(IS)定量，提高了分析的可靠性和準(zhǔn)確性。該方法操作簡便，快速，靈敏，成功應(yīng)用于孕婦血漿中Trp的代謝分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀(配有G1314A型紫外檢測器及G1321A 型熒光檢測器)購自美國Agilent 公司;HIMAC-cf 15低溫臺式離心機(日立工機株式會社);ShimaduLBRORAEL-200天平(日本島津公司);Millipore 超純水過濾裝置及Millipore真空泵(美國Millipore 公司);SB-3200超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)。

Trp、Kyn、5-Hiaa、Kyna和3-N-Tyr均購于美國Sigma 公司;甲醇、乙腈為色譜純，購于美國Tedia 公司;醋酸鋅、醋酸均為國產(chǎn)分析純;實驗用水經(jīng)Millipore 系統(tǒng)純化。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取一定量的Trp、Kyn、5-Hiaa、Kyna和3-N-Tyr 標(biāo)準(zhǔn)品，配制為濃度分別為20.0、9.60、5.23、5.81和12.8 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分裝后置于-20℃下保存?zhèn)溆?。使用前取?biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至所需濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 樣品采集與預(yù)處理

樣本采集:30例正常孕婦的血漿樣本取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，平均年齡(26±2)歲，無肝、腎、肺、血液等系統(tǒng)疾病。28例健康女性標(biāo)本取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康志愿者，其年齡與孕婦組相匹配。所有受試者于清晨空腹抽取前肘靜脈血2 mL，低速離心留血漿置于-20℃保存。

樣本預(yù)處理:取EDTA 抗凝血漿100μL，加入10μL 內(nèi)標(biāo)(IS)溶液(3-N-Tyr，640 nmol/L)和10μL 35%高氯酸溶液，渦旋混勻1 min，室溫靜置10 min 后，于4℃、13000 g 離心力下離心10 min 以沉淀血漿中的蛋白質(zhì)，取上清液50μL 進樣分析。

1.3 HPLC 條件

色譜柱為Hypersil C-18柱(250 mm ×4.0 mm，5μm);流動相:250 mmol/L 醋酸鋅溶液(pH 5.5)-乙腈(95∶5，v/v)，醋酸鋅溶液使用前經(jīng)0.22μm的濾膜過濾及超聲脫氣;柱溫30℃;流速0.8 mL/min;進樣量:50μL;紫外檢測波長程序:0～13 min，360 nm;13.01～17 min，302 nm。熒光檢測波長程序:0～10 min，激發(fā)光波長(λex)和發(fā)射光波長(λem)分別為278 nm和343 nm;10.01～14.30 min，λex和λem分別為244 nm和400 nm;14.31～17 min，λex和λem分別為302 nm和400 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC 條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定

固定色譜分離條件，對待測物進行光譜掃描。Kyn、IS和Trp 選用紫外檢測，使用Agilent 色譜工作站，分別對其紫外光譜進行掃描:Kyn 在225、258、360 nm 有吸收峰，由于Kyn 最先被洗脫出，此時檢測波長過低易受血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，而在360 nm 處大多數(shù)干擾物質(zhì)無吸收，且IS 在Kyn 后流出，其在360 nm 處有吸收，因此選擇360 nm 作為Kyn和IS的檢測波長;Trp 具有吲哚環(huán)，可發(fā)出自然熒光，但采用熒光檢測時與血中內(nèi)源性物質(zhì)有少許交叉，分離度小于1.5，而采用紫外檢測則能達到基線分離，Trp的最大吸收波長為278 nm，但此波長下Trp與Kyn的峰面積相差較大，而在302 nm 處Trp有吸收且其峰面積與Kyn 相近，利于內(nèi)標(biāo)量的確定從而達到準(zhǔn)確定量，因此選擇302 nm 為Trp的檢測波長。5-Hiaa和Kyna 在血液中的含量較低，需用熒光檢測。使用Agilent 色譜工作站，對其熒光光譜進行掃描，得到最大激發(fā)光波長(λex)分別為:λex，5-Hiaa=278 nm和λex，Kyna=244 nm;最大發(fā)射光波長(λem)分別為:λem，5-Hiaa=343 nm和λem，Kyna=400 nm，將各自最大的λex和λem作為檢測波長。本方法采用程序檢測波長可實現(xiàn)血漿中色氨酸及其3種代謝物的同時檢測。

2.1.2 醋酸鋅濃度的選擇

5-Hiaa和Kyna 在血液中的濃度很低，需經(jīng)醋酸鋅在線衍生才能達到分析要求。配制不同濃度(10、100、150、200、250、300 mmol/L)的醋酸鋅溶液(pH 為5.5)為流動相，對混合標(biāo)準(zhǔn)液進行分析，其中Kyna和5-Hiaa 用熒光檢測，Trp和Kyn 用紫外檢測，結(jié)果見圖1。這4種待測物經(jīng)醋酸鋅在線衍生后峰面積均有所增大，這是由于4種待測物的官能團如-COOH、-NH2中的N、O 等原子可提供孤對電子與Zn2+配位，使其形成配合物，從而響應(yīng)增強。當(dāng)醋酸鋅濃度低于200 mmol/L 時，這4種待測物的峰面積隨醋酸鋅濃度的增大而增加;當(dāng)醋酸鋅濃度大于200 mmol/L 時，隨醋酸鋅濃度的增大，Trp和Kyn的峰面積基本不變，5-Hiaa的峰面積約有下降，而Kyna的峰面積則持續(xù)增加。因血漿中Kyna 濃度較5-Hiaa 低，響應(yīng)信號較弱，當(dāng)醋酸鋅濃度達到250 mmol/L 時才能滿足分析要求，但醋酸鋅濃度過高易形成結(jié)晶堵塞色譜柱及其他儀器部件。本文選擇醋酸鋅濃度為250 mmol/L，此條件下柱壓為13.2 MPa。

2.1.3 流動相pH 對保留時間和峰面積的影響

圖1 流動相中醋酸鋅濃度對分析物峰面積的影響Fig.1 Effect of concentration of zinc acetate in mobile phase on peak areas of analytes

配制250 mmol/L 醋酸鋅溶液，并用醋酸調(diào)至不同pH 值(4.5、5.0、5.5、5.7、6.0)，對混合標(biāo)準(zhǔn)液進行分析，結(jié)果見圖2。pH 值對4種待測物的保留行為有較大的影響，pH 值為5.0左右時，Kyna和Trp，5-Hiaa和Kyn的保留時間很接近;而pH 值為6.0左右時，Kyna和Kyn的保留時間相近(圖2b)。隨著pH 值的降低，5-Hiaa和Kyn的峰面積基本不變，Trp和Kyna的峰面積降低(圖2a)，這是由于隨著酸度增加，更多的H+與流動相中的Zn2+競爭官能團上的配位點，使Zn2+衍生效率降低。綜合考慮，選用流動相的pH 值為5.5，此時4種待測物彼此能較好分離，且有利于衍生。

圖2 流動相pH 值對(a)峰面積和(b)保留時間的影響Fig.2 Effects of pH of mobile phase on(a)peak area and(b)retention time

2.2 方法學(xué)評價

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

配制含有內(nèi)標(biāo)的系列標(biāo)準(zhǔn)液，各取10μL 加入90μL 混合血漿中，按1.2節(jié)中“樣本預(yù)處理”項操作，以血漿中加入待測物的濃度為橫坐標(biāo)，血漿中待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值減去空白血漿中待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以S/N=3為方法的檢出限(LOD)，S/N=10為方法的定量限。結(jié)果見表1。

表1 Trp，Kyn，5-Hiaa和Kyna的線性關(guān)系、檢出限(LODs，S/N=3)及定量限(LOQs，S/N=10)Table 1 Linear relationships，limits of detection(LODs，S/N=3)and limits of quantification(LOQs，S/N=10)of Trp，Kyn，5-Hiaa，and Kyna

2.2.2 精密度和回收率

分別取含高、中、低濃度待測物的血漿樣本進行精密度測定，按1.2節(jié)中“樣本預(yù)處理”項操作。日內(nèi)每個濃度水平重復(fù)測定5次，連續(xù)測定5天。日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.02%～4.08%之間，日間RSD 在1.38%～3.95%之間，結(jié)果見表2。在90μL 健康人混合血漿中加入10μL 高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2節(jié)中“樣品預(yù)處理”項操作進行回收率測定。4種待測物的回收率在91.62%～114.17%之間。

表2 Trp、Kyn、5-Hiaa 及Kyna的回收率和精密度(n=5)Table 2 Recoveries and precisions of Trp，Kyn，5-Hiaa and Kyna(n=5)

2.3 干擾試驗

根據(jù)美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)制訂的關(guān)于干擾試驗的評價方案進行?？疾炷懠t素和溶血對測定Trp、Kyn、Kyna和5-Hiaa的影響。將膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉用甲醇溶解，配成濃度分別為5.6、2.8、1.4、0.70 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，取健康人混合血漿90μL，加入10μL 上述不同濃度的膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2節(jié)中“樣品預(yù)處理”項操作。分別測定未加(X0)和加入(X)膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液時血漿Trp，Kyn，Kyna和5-Hiaa的濃度，按照本研究所建立方法的SD 計算，干擾值=X -X0在對照組1.96s(95%置信區(qū)間)范圍內(nèi)為無顯著干擾。結(jié)果表明，血漿膽紅素濃度達到0.56 mmol/L(正常人為2～20μmol/L)時對測定結(jié)果也無影響。

取正常人EDTA 抗凝全血分成兩份，一份在4℃、2000 g 離心力下離心，分離血漿;另一份在-80℃和37℃間反復(fù)凍融直至全部溶血。用血漿配制成5%、10%、15%、30%、50%的溶血標(biāo)本，按1.2節(jié)“樣品預(yù)處理”項操作，每一濃度樣品重復(fù)測定3次。結(jié)果顯示，10%的溶血即對這4種物質(zhì)的測定有影響，其中隨著溶血程度的增加，Trp、Kyn和Kyna均顯著性降低，5-Hiaa 顯著性增加，這可能是因為溶血過程中血小板釋放出來大量5-Hiaa。

2.4 實際樣品測定

用該方法分別測定正常孕婦和對照組血漿中Trp、Kyn、Kyna和5-Hiaa的濃度，結(jié)果見表3;其中一位健康女性血漿的色譜圖如圖3所示。結(jié)果顯示:除5-Hiaa 濃度和Kyn/Trp 比值外，正常孕婦組Trp，Kyn，Kyna均顯著低于對照組，經(jīng)t 檢驗，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。正常孕婦Trp 經(jīng)Kyn 途徑(與免疫功能有關(guān))代謝異常，而Trp經(jīng)5-Hiaa 代謝則與對照組無顯著差異，表明正常孕婦免疫功能發(fā)生改變。

表3 孕婦組與對照組血漿中Trp，Kyn，5-Hiaa，Kyna含量及Kyn/Trp 比值Table 3 Concentrations of Trp，Kyn，5-Hiaa Kyna and the ratio of Kyn/Trp in plasma in pregnant and control group

圖3 一名健康女性血漿的色譜圖Fig.3 Chromatograms of the plasma of a healthy control

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜法同時測定血漿Trp、Kyn、5-Hiaa、Kyna的方法，利用醋酸鋅在線衍生及程序波長的高效液相色譜技術(shù)，采用內(nèi)標(biāo)法定量，線性相關(guān)性好，操作簡便，內(nèi)源性物質(zhì)干擾小，靈敏度高，適合于臨床與科研。

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