石冬琴，王榮*，謝華，田薇，賈正平*，郭建魁

(1.全軍高原損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院臨床藥理基地，甘肅蘭州 730050;2.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江臨安 311300)

K-ras 基因是ras 基因家族中3種癌基因的一種，為表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游基因，與結(jié)直腸癌關(guān)系密切［1］。我國(guó)大腸癌發(fā)病率已占到常見(jiàn)腫瘤的第四位，且發(fā)病率已達(dá)5%，高于2%的國(guó)際水平;每年新發(fā)病例約40萬(wàn)，其中30～40歲的中年人居多。各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的結(jié)直腸癌中K-ras 基因突變率并不相同，歐美為30%～68%［2，3］，而中國(guó)為14%～43.8%［4，5］。K-ras 基因最常見(jiàn)的激活方式是點(diǎn)突變，其中90%發(fā)生在第一外顯子的第12、13位密碼子上，其中70%發(fā)生于第12位密碼子，30%發(fā)生于第13位密碼子［6］;極少文獻(xiàn)報(bào)道第19、61、63位密碼子發(fā)生突變。第12、13位密碼子常用的檢測(cè)方法主要有DNA 測(cè)序［7］。根據(jù)結(jié)直腸癌患者中Kras 基因是野生型還是突變型，將傳統(tǒng)意義上的一種疾病分成兩種獨(dú)立的疾病進(jìn)行治療。結(jié)直腸癌患者中K-ras 基因?yàn)橥蛔冃偷募s占40%，而其余60%左右的K-ras 基因?yàn)橐吧停壳芭R床治療中抗EGFR靶向藥物對(duì)K-ras 野生型大腸癌患者療效顯著，而對(duì)突變型無(wú)效，如不加區(qū)分采取同一種藥物治療將會(huì)增加不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用。因此，對(duì)K-ras突變類(lèi)型的檢測(cè)［7-13］，可以篩選出抗EGFR 靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療，從而達(dá)到良好的預(yù)后，延長(zhǎng)患者生存期。臨床統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，大腸原發(fā)病灶的患者手術(shù)后5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，即病情分期越晚者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)越高。早期檢測(cè)K-ras 基因，可早期治療，從而有效降低病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。因此，檢測(cè)K-ras 基因第12/13位密碼子的突變情況，對(duì)于結(jié)直腸癌的臨床早期診斷、治療和預(yù)后有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)(CE-LIF)結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)技術(shù)，采用作者所在課題組已建立的CE-SSCP 方法檢測(cè)了臨床結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本和經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE，formalin-fixed and paraffin-embedded)同一組織標(biāo)本中K-ras 基因第12/13位密碼子突變，并應(yīng)用DNA 直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果可為結(jié)直腸癌的臨床診斷和治療提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

P/ACE System5000型毛細(xì)管電泳儀、P/ACE System5000 station 數(shù)據(jù)處理軟件、P/ACE System laser module 488 nm 激光檢測(cè)器(美國(guó)Beckman 公司);石英毛細(xì)管柱(河北永年光導(dǎo)纖維廠);DYY-8C 型電泳儀、DYCZ-24E 型電泳槽(北京市六一儀器廠);AE240型電子天平(瑞士Mettler 公司);高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus 公司);PCR 擴(kuò)增儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)。

聚環(huán)氧乙烷(PEO，Mr=300000)、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸銨(APS)、丙烯酰胺(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，γ-甲基丙烯?；?三(甲氧基)硅烷(MAPS)(Johson Matthey 公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司)，硼酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(天津化學(xué)試劑廠)，SanPrep柱式PCR 產(chǎn)物回收試劑盒SK8142、Taq DNA 聚合酶、PCR 試劑、DNA Marker-B GM331、6× Loading Dye Solution SD8314、pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，Golden View 核酸染料、核酸染料SYBR Green Ⅰ(10000×，50μL/支;廈門(mén)百維信公司)，以上試劑均為分析純。

0.5× Tris-硼酸(TBE)緩沖液成分:0.045 mol/L Tris-硼酸+0.001 mol/L EDTA;1×Tris-乙酸(TAE)緩沖液成分:0.04 mol/L Tris-乙酸+0.001 mol/L EDTA。

樣品測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

結(jié)直腸癌及癌旁正常組織樣本(包括臨床手術(shù)后組織和經(jīng)FFPE 處理的同一組織)共76例152個(gè)樣本，其中男53例，女23例，年齡20～84歲，平均年齡(65±2)歲。所有標(biāo)本取自蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科，結(jié)直腸部切除組織并經(jīng)病理切片證實(shí)，其中高分化腺瘤6例，中分化腺瘤46例，低分化腺瘤13例，黏液腺瘤11例。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 DNA 提取

結(jié)直腸癌及癌旁正常組織的DNA 提取:用扭力天平稱(chēng)取結(jié)直腸癌及癌旁正常組織40 mg，剪碎勻漿后加入蛋白酶-K 消化，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取基因組DNA。采用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的基因組DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，在260、280 nm波長(zhǎng)下的光密度D的比值(D260/D280)為1.7～1.9，符合DNA 檢測(cè)要求。于-20℃下保存待用。

FFPE 組織標(biāo)本的DNA 提取:用電子天平稱(chēng)取石蠟切片20～25 mg，放入2 mL的無(wú)菌離心管中。首先對(duì)其進(jìn)行脫蠟:加入1 mL的二甲苯充分搖勻，于3000×g 下離心2 min，棄去上清液;加入1 mL無(wú)水乙醇混勻，于3000×g 下離心2 min，棄去上清液，再重復(fù)脫蠟一次;然后依次用100%、95%和75%的乙醇各1 mL 洗至沉淀為松散的白色。脫蠟完全后的組織由原來(lái)的粉紅透明狀變?yōu)樗缮⒌陌咨恋頎?。然后?duì)其進(jìn)行消化:將脫蠟后的組織放入37℃溫箱中15～30 min，待乙醇揮發(fā)干凈后，加入200μL的STE 溶液(100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，8 g/L SDS)，于90℃水浴鍋中加熱10 min 后，加入20 g/L 蛋白酶-K，在55℃水浴中加熱3 h 以上直至絮狀物消失。于3000×g下離心1 min，取上清液，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取基因組DNA，D260/D280值為1.7～1.9，于-20℃下保存待用。

1.2.2 K-ras 基因的PCR 擴(kuò)增及純化

所選引物為文獻(xiàn)［14］中所述的K-ras 基因第一外顯子第12/13位密碼子所需特異性引物，上游引物:5'-AGGCCTGCTGAAATGACTGAATA-3，下游引物:5'-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約184 bp。PCR 反應(yīng)體系為25μL，其中含dNTP 200μmol/L、引物0.05μmol/L、Taq 聚合酶5 U/μL、模板DNA 0.5μg。PCR 反應(yīng)循環(huán)條件:94℃變性30 s，59.6℃退火30 s，72℃延伸30 s，共行30個(gè)循環(huán)。由于擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的引物二聚體以及dNTP、引物、鎂離子等會(huì)影響分析結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物回收試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

取純化后PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，加入1μL 6×蛋白上樣染料溶液(Loading Dye Solution)進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳緩沖液為1×TAE 緩沖液(pH 8.5)，用Golden View 核酸染料染色，并用凝膠成像分析系統(tǒng)照相和分析結(jié)果。

1.2.4 CE-SSCP 檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)［15］的方法涂層毛細(xì)管柱(37 cm ×75μm，有效長(zhǎng)度27 cm)。取5μL PCR 產(chǎn)物加入純水20μL，95℃變性15 min，立即在冰浴中放置5 min，于3000×g 下離心10 s。向25μL 經(jīng)變性處理的樣品中加入5μL SYBR GreenⅠ并混合均勻，在10 kV電壓下負(fù)極電動(dòng)進(jìn)樣15 s，采用課題組已建立的以3% PEO 為篩分介質(zhì)分離pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker的最佳分離條件，對(duì)結(jié)直腸癌臨床手術(shù)直接取用組織和FFPE 組織標(biāo)本中的K-ras 基因的第12/13位密碼子的突變情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 DNA 測(cè)序分析

用ABI-PRISM 3730測(cè)序儀測(cè)序驗(yàn)證經(jīng)CE-SSCP 檢測(cè)的樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker 最佳分離條件

采用課題組已建立的CE 分離pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker的最佳條件［15］:篩分介質(zhì)PEO的含量為3%、緩沖液TBE的pH 8.3、電壓15 kV、溫度15℃。CE 分離結(jié)果如圖1所示:共得到11個(gè)峰，基本達(dá)到基線分離，15 min 內(nèi)達(dá)到完全分離。表明建立的方法具有分離快速、分離度良好的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2%瓊脂糖凝膠電泳分析純化的擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織的電泳擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2可見(jiàn)，擴(kuò)增獲得了純度較高的目的產(chǎn)物。

圖1 毛細(xì)管電泳分離pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker Fig.1 Electropherogram of pUC19 DNA/MspⅠ(Hpa Ⅱ)Marker separation by CE

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的譜圖Fig.2 Electropherogram of PCR amplification by AGE

2.3 CE-SSCP 結(jié)果

SSCP 分析的原理是基于單鏈DNA 具有不同的構(gòu)象，DNA 鏈上單個(gè)堿基的變化會(huì)引起其構(gòu)象的變化，構(gòu)象不同則電泳淌度隨之改變，通過(guò)電泳將構(gòu)象上有差異的單鏈分離。臨床手術(shù)所取樣品按照1.2.4節(jié)的條件處理，獲得變性樣品，經(jīng)CE-LIF 檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3a 為結(jié)直腸癌旁正常組織擴(kuò)增變性樣品，圖3b 為結(jié)直腸癌組織擴(kuò)增變性樣品。比較上述兩圖，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中除有正常樣品的野生型單鏈DNA 外，還存在有異常單鏈DNA，即結(jié)直腸癌K-ras 基因第12/13位密碼子突變樣本中除具有野生型DNA 變性后會(huì)有的兩個(gè)單鏈DNA 外，還存在突變基因變性后的兩條單鏈DNA。因此，可通過(guò)癌旁正常組織(圖3a)的電泳譜圖(作為野生型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖)判讀癌組織突變型(圖3b)的K-ras 基因第12/13位密碼子的突變是否發(fā)生。

FFPE 組織標(biāo)本和臨床手術(shù)直接取用組織樣品的檢測(cè)結(jié)果一致。

通過(guò)CE-LIF 檢測(cè)各類(lèi)組織樣品，證實(shí)所建立的方法可有效地檢測(cè)結(jié)直腸癌K-ras 基因第12/13位密碼子的突變。

圖3 CE-SSCP 檢測(cè)變性(a)結(jié)直腸癌旁正常組織和(b)結(jié)直腸癌組織的DNA 電泳圖Fig.3 Electropherograms of degenerated DNA samples of(a)normal tissue and(b)colorectal cancer tissue by CE-SSCP

2.4 測(cè)序結(jié)果

為進(jìn)一步確認(rèn)CE-LIF 檢測(cè)的樣本發(fā)生突變的類(lèi)型，對(duì)相應(yīng)樣本進(jìn)行了測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示，K-ras 基因突變?yōu)閱蝹€(gè)堿基點(diǎn)突變，即K-ras 基因第12位密碼子主要突變類(lèi)型有GGT→GAT、GGT→GCT和GGT→CGT;第13位密碼子主要突變?yōu)镚GC→GAC，其中以堿基G 替換為堿基A(G→A)的點(diǎn)突變?yōu)橹鳌?/p>

2.5 臨床樣本K-ras 基因突變結(jié)果

分別對(duì)76例患者臨床手術(shù)切除組織獲得的癌組織及癌旁組織共計(jì)152個(gè)樣本進(jìn)行K-ras 突變基因第12、13位密碼子檢測(cè)，經(jīng)CE-LIF 檢測(cè)和基因測(cè)序，表明CE-SSCP 檢測(cè)和基因測(cè)序結(jié)果一致，K-ras基因第12、13位密碼子突變類(lèi)型見(jiàn)表1。

表1 76例患者中K-ras 基因第12、13位密碼子突變類(lèi)型的CE-LIF 檢測(cè)和基因測(cè)序結(jié)果Table 1 Results of codons 12 and 13 mutation type of K-ras in the 76 cases by CE-LIF and gene sequencing

3 結(jié)論

采用課題組已建立的方法［15］檢測(cè)了76例結(jié)直腸癌患者組織中K-ras 基因第12/13位密碼子突變情況，結(jié)果顯示30例發(fā)生突變，突變率為39.5%(30/76)，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)的結(jié)果(14%～43.8%)［4，5］一致。結(jié)直腸癌患者中K-ras 基因的高突變率，表明K-ras 基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展中有重要作用?；蛲蛔兂Ｒ詨A基的缺失、插入、替代為主，從而引起癌基因的激活與抑癌基因的失活。本研究通過(guò)直接測(cè)序證實(shí)，K-ras 基因堿基發(fā)生點(diǎn)突變，以堿基G 替換為堿基A 為主要突變類(lèi)型，其中第12位密碼子GGT 突變?yōu)镚AT的突變率為28.9%(22/76)，第13位密碼子GGC 突變?yōu)镚AC的突變率為5.3%(4/76)。與以往文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)人K-ras 基因突變以第12位密碼子(GGT→GAT)多見(jiàn)［4］的結(jié)果一致。

盡管已有文獻(xiàn)［16］報(bào)道采用CE 方法對(duì)K-ras 基因進(jìn)行了檢測(cè)，但本研究結(jié)果證實(shí)，作者所在課題組所建立的以3%PEO 為篩分介質(zhì)的CE-SSCP 分析方法可以在11 min 內(nèi)分離pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker 11個(gè)DNA 片段及4個(gè)單鏈DNA(ssDNA)，較文獻(xiàn)報(bào)道的以6%線性聚丙烯酰胺為篩分介質(zhì)的CE 方法分離時(shí)間短，且多次檢測(cè)證實(shí)分析條件穩(wěn)定。

近年來(lái)，靶向藥物的出現(xiàn)為結(jié)直腸癌的治療帶來(lái)了希望，但治療效果與K-ras 基因突變與否有密切的關(guān)系，因此K-ras 基因突變與抗結(jié)直腸癌治療效果的相關(guān)性受到人們的重視，K-ras 基因突變的檢測(cè)在治療及預(yù)后方面有重要意義。同時(shí)，K-ras 基因突變的檢測(cè)有助于實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的個(gè)體化，不僅可以提高藥物療效，減輕患者病痛，而且能夠減少患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療支出。此外，CE-SSCP 法與直接基因測(cè)序法相比，具有操作簡(jiǎn)單、運(yùn)行成本低、不需要設(shè)計(jì)檢測(cè)探針的優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床批量檢測(cè)。

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