金靜，陳吉平，田玉增，鄒黎黎，王龍星，李芳

(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023)

中國(guó)菜系由于其味道鮮美、種類繁多而著稱，其中川菜和湘菜最具代表性。這些菜系的制備不可或缺的食材即是植物油，這也促進(jìn)了植物油在我國(guó)日常飲食業(yè)中的普及。因此，植物油的品質(zhì)關(guān)系我們的日常飲食安全。近幾年來(lái)，由于不法分子的投機(jī)行為，“地溝油”不斷滲透到我國(guó)飲食業(yè)中，嚴(yán)重危害人們的身體健康。“地溝油”檢測(cè)成為監(jiān)督、監(jiān)管植物油安全的重要途徑。

“地溝油”(illegal cooking oils，簡(jiǎn)稱ICO)是一個(gè)泛指概念，是對(duì)各類劣質(zhì)油的統(tǒng)稱，一般包括潲水油、煎炸廢油、食品及相關(guān)企業(yè)產(chǎn)生的廢棄油脂等。由于其來(lái)源復(fù)雜、種類各異，雖然不斷有檢測(cè)方法見(jiàn)諸報(bào)道［1，2］，但方法的特異性稍顯不足。例如通過(guò)固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定油脂樣品中的膽固醇含量鑒定植物油中是否摻有“地溝油”的檢測(cè)方法［3］，雖然在一定程度上可以鑒別含有動(dòng)物源性的“地溝油”，但卻無(wú)法識(shí)別因反復(fù)煎炸所形成的植物源性“地溝油”。同樣通過(guò)外源性添加物(如辣椒素)鑒定地溝油在很大程度上解決了地溝油檢測(cè)難的問(wèn)題［4，5］，但該指示物卻也無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別植物源性“地溝油”。采用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)檢測(cè)多組分T2弛豫圖譜以及峰面積比例S21和單組分弛豫時(shí)間T2w，可以有效反映煎炸油的品質(zhì)變化［6-8］，為低場(chǎng)核磁共振技術(shù)應(yīng)用于煎炸廢油檢測(cè)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù);但該方法的局限性在于僅適用于植物源性“地溝油”。為此，吳惠勤等［9，10］分別從“地溝油”的內(nèi)、外源性微量成分出發(fā)，通過(guò)對(duì)各種純正植物油中的內(nèi)源性微量成分與不同地區(qū)“地溝油”中的外源性雜質(zhì)成分的對(duì)比分析，以及對(duì)“地溝油”中雜質(zhì)成分來(lái)源的分析，確定了一系列特征指示物。其中內(nèi)源性特征成分包括正戊醛、正己醛等醛類物質(zhì)和香氣類物質(zhì)，如吡嗪類物質(zhì)、蒎烯;而不同地區(qū)“地溝油”的外源性物質(zhì)具有較大差異。這些種類繁多的指示物勢(shì)必給分析檢測(cè)和結(jié)果判定帶來(lái)一定困難，限制了該方法的推廣和使用。

我們課題組在綜合分析“地溝油”來(lái)源的差異性后，通過(guò)非靶標(biāo)/靶標(biāo)篩查，分別確立了“地溝油”的內(nèi)、外源性特征指示物［11］，即十一烷酸、13-甲基十四烷酸和辣椒素類物質(zhì)。其中，十一烷酸主要來(lái)源于深度煎炸植物油，13-甲基十四烷酸主要來(lái)源于動(dòng)物油。通過(guò)二者和十五烷酸的比值，可以從內(nèi)源性特異成分出發(fā)有效鑒定“地溝油”。然而，該方法也有少許局限性。例如，對(duì)于芝麻油來(lái)說(shuō)，由于其本身含有的十五烷酸含量較低，導(dǎo)致十一烷酸、13-甲基十四烷酸和十五烷酸的比值均偏高，最終結(jié)果可能會(huì)將芝麻油或者含有芝麻油的植物油錯(cuò)判為“地溝油”?！板e(cuò)判”是在“地溝油”檢測(cè)方法研制過(guò)程中必須要克服或避免的原則問(wèn)題。因此，為了彌補(bǔ)此方法的不足之處，降低在“地溝油”判定過(guò)程中可能存在的錯(cuò)判問(wèn)題，滿足衛(wèi)生部對(duì)“地溝油”檢測(cè)方法的要求，本項(xiàng)研究通過(guò)篩查合適的內(nèi)標(biāo)，建立了甘油酯上十一烷酸和13-甲基十四烷酸內(nèi)標(biāo)分析法，以達(dá)到對(duì)“地溝油”更精準(zhǔn)識(shí)別的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

MDGC-GCMS-QP2010多維氣相色譜-質(zhì)譜儀(日本Shimadzu 公司);Vortex Genie2渦旋混合器(德國(guó)IKA 公司);PCV-2400離心機(jī)(北京首選科技有限公司)。

十一烷酸甲酯(純度≥99.0%)、13-甲基十四烷酸甲酯(純度≥98%)購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，內(nèi)標(biāo)物十八烷烴(分析純)購(gòu)自上海試劑總廠。甲醇和正己烷均為色譜純(Fisher 公司);氫氧化鉀和氯化鈉為分析純;壬烷(農(nóng)殘級(jí));大豆油、花生油、玉米油、葵花油、菜籽油、調(diào)和油、芝麻油、橄欖油等均為購(gòu)自地方大型超市的食用油;“地溝油”或摻雜“地溝油”的食用油由國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 樣品的制備

樣品衍生化步驟參照食用植物油中特征奇數(shù)碳脂肪酸的多維氣相色譜-質(zhì)譜法［11］，準(zhǔn)確稱取0.08 g 待測(cè)油樣，加入500μL 含內(nèi)標(biāo)物十八烷烴的正己烷和500μL 2 mol/L 氫氧化鈉的甲醇溶液，充分渦旋(約3 min)。離心，待溶液分層后，取上層溶液加入500μL 飽和食鹽水，渦旋約1 min 后離心。上層正己烷溶液用于多維氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取十一烷酸甲酯和13-甲基十四烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用壬烷溶解并定容至1.00 mL，配制成10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液Ⅰ。置于-20℃冰箱中保存。

準(zhǔn)確稱取十八烷烴標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用壬烷溶解至1.00 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Ⅱ。

以正己烷為溶劑，將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液Ⅰ和Ⅱ逐級(jí)稀釋，二者配制成質(zhì)量濃度比為1∶10，1∶5，1∶1的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，其中十八烷烴的質(zhì)量濃度固定為15 mg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 相對(duì)響應(yīng)因子的測(cè)定

將標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液分別注入多維氣相色譜-質(zhì)譜儀，測(cè)定十一烷酸甲酯和13-甲基十四烷酸甲酯和十八烷烴的峰面積。結(jié)合內(nèi)標(biāo)物的已知含量，分別計(jì)算它們和十八烷烴的相對(duì)響應(yīng)因子，求其平均值。

1.2.4 試樣溶液的測(cè)定

將試樣提取液注入多維氣相色譜-質(zhì)譜儀，分別測(cè)得十一烷酸甲酯(m/z 200)、13-甲基十四烷酸甲酯(m/z 256)和十八烷烴(m/z 254)的峰面積比，平行測(cè)定兩次。

1.3 多維氣相色譜-質(zhì)譜條件

第一維色譜條件:色譜柱為UF-1MS 毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm ×0.25μm，中譜科技銳分系列)，進(jìn)樣口溫度260℃，F(xiàn)ID 溫度280℃，不分流進(jìn)樣(不分流時(shí)間0.8 min)，載氣流速0.84 mL/min，進(jìn)樣量1μL。爐溫升溫程序:60℃保持1min，然后以30℃/min 升至180℃，保持1 min，再以3℃/min 升至280℃，保持20 min。切割時(shí)間段為11.40～14.67 min和18.75～21.00 min。

第二維色譜條件:色譜柱為UF-mFFAP 毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m ×0.25 mm ×0.25μm，中譜科技銳分系列);爐溫升溫程序:50℃保持21.5 min，然后以30℃/min 升至100℃，再以10℃/min 升至200℃，最后以30℃/min 升至220℃，保持20 min。載氣流速:1.16 mL/min。

四極桿質(zhì)譜參數(shù):檢測(cè)方式:選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM);電離方式:電子轟擊源(EI，70 eV);離子源溫度:200℃;傳輸線溫度:250℃;十一烷酸甲酯的定量離子為m/z 200，定性離子為m/z 169;13-甲基十四烷酸甲酯的定量離子為m/z 256，定性離子為m/z 225;十八烷烴的定量離子為m/z 254，定性離子為m/z 225。

1.4 定量方法

1.4.1 相對(duì)響應(yīng)因子的計(jì)算

式中:F1、F2分別指標(biāo)準(zhǔn)溶液中十一烷酸甲酯、13-甲基十四烷酸甲酯和十八烷烴的相對(duì)響應(yīng)因子;A0，s、A1，s、A2，s分別指標(biāo)準(zhǔn)溶液中十八烷烴特征離子(m/z 254)、十一烷酸甲酯特征離子(m/z 200)以及13-甲基十四烷酸甲酯特征離子(m/z 256)的峰面積;C0，s、C1，s、C2，s分別指標(biāo)準(zhǔn)溶液中十八烷烴、十一烷酸甲酯和13-甲基十四烷酸甲酯的含量，單位為mg/L。

1.4.2 油樣中特征脂肪酸的含量計(jì)算

油樣中十一烷酸和13-甲基十四烷酸含量的計(jì)算:

式中:C0為內(nèi)標(biāo)物十八烷烴的含量(mg/L);C1、C2分別指試樣中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量(mg/kg);A0、A1、A2分別指試樣中十八烷烴特征離子(m/z 254)、十一烷酸甲酯特征離子(m/z 200)以及13-甲基十四烷酸甲酯特征離子(m/z 256)色譜峰面積;M 為油樣的質(zhì)量(kg);V 為正己烷的體積(L)，數(shù)值為0.0005;Ci為重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值，結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后2位。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的檢出限與重復(fù)性

以棕櫚油為測(cè)定對(duì)象，按照本方法進(jìn)行前處理、儀器分析、定性和定量操作，并按照一定比例稀釋至目標(biāo)分析物的信噪比為10，此時(shí)重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;取標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍，結(jié)果修約為1位有效數(shù)字作為方法檢出限。該方法中，十一烷酸和13-甲基十四烷酸的方法檢出限分別為0.070 mg/kg和0.006 mg/kg。

按照本方法由同一操作者對(duì)某個(gè)樣品從取樣稱量開(kāi)始，平行做5份，測(cè)定結(jié)果之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差即為方法重復(fù)性。十一烷酸和13-甲基十四烷酸的方法重復(fù)性分別為9.1%、13.8%。

2.2 實(shí)際油樣的檢測(cè)

研究表明，“地溝油”的內(nèi)源性特征指示物主要是連接在甘油酯上的十一烷酸或者13-甲基十四烷酸，其含量與正常植物油存在顯著差異［11］。當(dāng)反復(fù)煎炸的植物油摻雜到正常食用植物油中時(shí)，十一烷酸的含量相對(duì)正常食用植物油高;當(dāng)泔水油、潲水油摻雜到正常食用植物油中時(shí)，13-甲基十四烷酸的含量相對(duì)正常食用植物油偏高。雖然通過(guò)兩者與十五烷酸的含量比值可以定量地將“地溝油”與正常食用植物油進(jìn)行有效區(qū)分，但仍然缺乏其絕對(duì)量的參考數(shù)值。因此，檢測(cè)實(shí)際油樣中連接在甘油酯上的十一烷酸和13-甲基十四烷酸的絕對(duì)量，可以為“地溝油”的鑒定提供數(shù)據(jù)支持。圖1給出了內(nèi)標(biāo)法測(cè)定十一烷酸和13-甲基十四烷酸的甲酯化產(chǎn)物的提取離子流色譜圖。從中可以看出以十八烷烴作為內(nèi)標(biāo)物，可以較好地校正目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)差異，為準(zhǔn)確定量奠定基礎(chǔ)。

2.2.1 正常食用植物油的檢測(cè)

以日常生活中人們經(jīng)常食用的植物油(主要包括大豆油、玉米油、堅(jiān)果油、花生油、棕櫚油、調(diào)和油、葵花籽油和菜籽油)為研究對(duì)象。通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)其中含有的連接在甘油酯上的十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，所得結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，不同種類植物油中所含有的十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量差異較大，葵花籽油中的含量較低，而棕櫚油中的含量均較高;不同品牌的同種植物油中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量差異較大，其中不同品牌的玉米油和花生油中十一烷酸的含量差異較大，而不同品牌的花生油和菜籽油中13-甲基十四烷酸的含量差異較大。上述研究結(jié)果表明:可能由于食用植物油本身性質(zhì)的差異、精煉工藝的不同，甚至部分購(gòu)置的正常植物油(尤其是花生油)已經(jīng)受到非正常油脂的污染，導(dǎo)致十一烷酸和13-甲基十四烷酸在不同種類植物油或者不同品牌的同種植物油之間存在較大差異。

圖1 多維氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)待測(cè)油樣中的十一烷酸和13-甲基十四烷酸Fig.1 Determination of undecanoic acid and 13-methyltetradecanoic acid with multidimensional gas chromatography-mass spectrometry(MDGCMS)

2.2.2 非正常食用植物油的檢測(cè)

與正常食用植物油不同，非正常食用植物油中可能摻雜了深度煎炸的植物老油或者泔水油、潲水油等。根據(jù)我們的研究，這些非正常植物油中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量由于摻雜種類以及程度的不同表現(xiàn)出一定的差異。為此，針對(duì)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心發(fā)放的油脂樣本，我們通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)其中含有的十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。從表2中可以看出，(1)肯德基濾油(棕櫚油)中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量均增大，這是因?yàn)椴捎米貦坝头磸?fù)煎炸食物(如雞肉、牛肉、豬油)時(shí)，伴隨著動(dòng)物油油脂的摻入，該油同時(shí)具有了植物源性和動(dòng)物源性“地溝油”的特征——十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量增大。(2)對(duì)于不同地區(qū)的“地溝油”而言，由于其來(lái)源差異，因此十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量具有顯著的差別。如新疆、重慶、貴州的“地溝油”可能由于羊肉的大量使用以及火鍋的盛行，導(dǎo)致動(dòng)物源性特征指示物13-甲基十四烷酸的含量較高;而摻雜了泰鑫“地溝油”的植物油中十一烷酸的含量明顯增大，推測(cè)該類“地溝油”可能主要由深度煎炸老油組成。這些結(jié)果均表明“地溝油”中兩種特征指示物的含量受我國(guó)地方菜系、飲食方式等的影響。(3)摻雜不同比例“地溝油”的植物油中十一烷酸或者13-甲基十四烷酸的含量呈現(xiàn)梯度變化，表明所建立的“地溝油”鑒定方法可以在一定程度上反映“地溝油”的摻雜情況。(4)某些“地溝油”樣品，如廣州“地溝油”2號(hào)、遼寧食用“地溝油”和新疆“地溝油”11號(hào)中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量較低，和正常食用植物油中二者的含量相差不大，在定性是否摻雜“地溝油”時(shí)存在不確定性，影響“地溝油”鑒定的準(zhǔn)確性。綜上所述，根據(jù)檢測(cè)待測(cè)油脂中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量，開(kāi)展其與正常食用植物油中含量的比對(duì)，可以推斷待測(cè)植物油的品質(zhì)，為開(kāi)展市場(chǎng)在售植物油的品質(zhì)普查和監(jiān)督提供技術(shù)支持。

表1 正常食用植物油中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量Table 1 Contents of undecanoic acid and 13-methyl-tetradecanoic acid in normal vegetable oils

表2 地溝油以及摻雜地溝油的食用油中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量Table 2 Contents of undecanoic acid and 13-methyltetradecanoic acid in illegal cooking oils(ICO)and edible oils containing ICO

2.2.3 干擾來(lái)源分析

以十八烷烴作為內(nèi)標(biāo)，可以準(zhǔn)確測(cè)定油脂中連接在甘油酯上的十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量。結(jié)合正常食用植物油中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的測(cè)定值，可以約束非正常植物油中二者的含量范圍，從而對(duì)非正常植物油或者摻雜非正常植物油的植物油進(jìn)行有效甄別。研究結(jié)果表明，不同地區(qū)來(lái)源的非正常植物油中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量有明顯區(qū)別。有些地區(qū)的“地溝油”中十一烷酸的含量較高，表明其深度煎炸的可能性較高，即植物源性“地溝油”的成分較高;有些地區(qū)的“地溝油”中13-甲基十四烷酸的含量較高，表明動(dòng)物油特異成分高，即動(dòng)物源性“地溝油”的成分較高。但是，對(duì)于某些“地溝油”或摻雜“地溝油”的植物油而言，可能由于“地溝油”的其他復(fù)雜來(lái)源或者摻雜比例較小，十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量均較低，甚至和植物油中二者的含量相差不大。此時(shí)，單純依靠十一烷酸和13-甲基十四烷酸的絕對(duì)含量進(jìn)行判定，有可能會(huì)使部分非正常植物油漏檢。這是因?yàn)橐恍┱Ｖ参镉?如椰子油、棕櫚油)中本身含有相當(dāng)量的十一烷酸和13-甲基十四烷酸，在制定非正常植物油中二者的含量范圍時(shí)，為了盡可能避免錯(cuò)判的可能性，不得已將限定值拔高。這樣勢(shì)必將某些含有低水平目標(biāo)物的油脂漏檢，降低了判定的準(zhǔn)確性。因此，在地溝油判定過(guò)程中，需要分別結(jié)合椰子油、棕櫚油中十一烷酸和13-甲基十四烷酸的含量，將待測(cè)油樣中可能因?yàn)槠浯嬖诙氲母蓴_消除。

3 結(jié)論

本項(xiàng)研究以十八烷烴為內(nèi)標(biāo)，建立了十一烷酸和13-甲基十四烷酸的多維氣相色譜-質(zhì)量分析方法。該方法具有在線富集、凈化的目的，不僅提高了分析靈敏度、降低了檢出限，而且定量準(zhǔn)確度較高。基于非正常植物油中連接在甘油酯上的十一烷酸和13-甲基十四烷酸具有較高的含量，本研究通過(guò)建立的分析方法實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)油樣(包括正常食用植物油)中甘油酯上十一烷酸和13-甲基十四烷酸的定量分析。結(jié)合數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，可以制定十一烷酸和13-甲基十四烷酸這兩種內(nèi)源性特征指示物的限值，從而達(dá)到甄別非正常植物油摻偽的目的。

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