陳 迪 朱 堅(jiān) 樊 祥 于瑞祥 鄧曉軍 韓 麗 郭德華 伊雄海 黃 帆 張 欣

(1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局 上海 200135;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院)

1 前言

二氯二甲吡啶酚是一種預(yù)防雞球蟲病的飼料藥物添加劑，在國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)中被廣泛應(yīng)用，長期使用或不按規(guī)定用藥會(huì)造成二氯二甲吡啶酚在動(dòng)物體內(nèi)和組織中殘留。近年來藥物殘留一直是動(dòng)物及動(dòng)物源產(chǎn)品國際貿(mào)易中令人關(guān)注的焦點(diǎn)之一，歐盟以及美國、日本、中國都已規(guī)定并不斷修訂各種動(dòng)物組織中二氯二甲吡啶酚殘留的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。美國、加拿大、日本和中國均規(guī)定禽肉組織中二氯二甲吡啶酚殘留限量為5 μg/kg，禽肝臟中二氯二甲吡啶酚殘留限量為15 μg/kg。

國內(nèi)外關(guān)于二氯二甲吡啶酚殘留量的分析報(bào)道不多，主要有氣相色譜法［1，2］、液相色譜法［3，4］和色譜－質(zhì)譜法［5，6］。氣相色譜法一般通過酸酐酯化將二氯二甲吡啶酚分子中的極性羥基去衍生化后形成易于汽化的酯類衍生物，再采用電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)，但檢測(cè)時(shí)干擾多;液相色譜法一般需經(jīng)兩次固相萃取凈化，前處理步驟繁多，靈敏度達(dá)不到現(xiàn)行限量要求，選擇性也較差。因此開發(fā)一種能簡單、靈敏、可靠的檢測(cè)二氯二甲吡啶酚的方法具有重要的意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

雞肉和雞肝均購于超市。

2.1.2 儀器

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent7890/7000;組織攪拌機(jī)：瑞士Kinematica公司;渦旋混合器：韓國VisionScientific Co.Lt;高速離心機(jī)：日本Hitachi公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司;氮?dú)鉂饪s儀：美國Zy-mark 公司;天平：0.1 mg 和 0.01 g;玻璃層析柱：20 mm i.d.×200 mm;梨形瓶：250 mL;Milli－ Q 高純水發(fā)生器：美國Millipore公司。

2.1.3 試劑

甲醇：色譜純，德國Merck公司;正己烷：分析純，美國 J.T.Baker公司;丙酸酐：純度≥98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;吡啶：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;四硼酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;中性氧化鋁：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水。

二氯二甲吡啶酚標(biāo)準(zhǔn)品：購自Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥98%。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以甲醇配成0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

移取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容后即成1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

2.2.2 前處理

稱取5 g試樣 (精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇，均質(zhì)2 min;以4000 r/min速率離心10 min。

用移液管移取20 mL上清液于氧化鋁柱中，當(dāng)液面與氧化鋁上表面相切時(shí)加入10 mL甲醇淋洗，棄去流出液;然后用45 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于250 mL梨形瓶中;50℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干;用2 mL甲醇溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)入15 mL帶螺旋蓋離心管，并用1 mL甲醇洗滌梨形瓶，合并;用氮?dú)饬鞔抵链蠹s0.5 mL。

在上述試管中依次準(zhǔn)確加入4 mL0.1 mol/L四硼酸鈉溶液，0.50 mL 正己烷，25μL 吡啶和 50 μL丙酸酐;加塞，渦旋混合1 min，4500 r/min離心5 min;將上層正己烷移入進(jìn)樣小瓶中，供氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

2.2.3 色譜條件

色譜柱：毛細(xì)管柱DB－5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序：初始溫度 50 ℃保持 1 min，以20℃/min升高到250℃后保持5 min;進(jìn)樣口溫度：260 ℃;流速：1.0 mL/min;載氣：氦氣，純度≥99.999%;進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣，1 min后開閥;進(jìn)樣量：1 μL。

2.2.4 質(zhì)譜參數(shù)

接口溫度：280℃;離子源：電子轟擊源 (EI);碰撞能量：15 eV;離子源溫度：230℃;檢測(cè)方式：MRM;離子對(duì)(m/z)：191/128，191/156。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取方法的優(yōu)化

對(duì)于樣品的提取，原來標(biāo)準(zhǔn)采用振蕩抽濾的方法，要加入助濾劑改善過濾速度。本方法采用均質(zhì)后以4000 r/min離心10 min后移取部分上清液進(jìn)行后續(xù)凈化操作，使過程簡化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用此方法可使提取更完全，提取率更高且更穩(wěn)定。離心分離后，液相清澈，液固界面非常明顯。另外，直接移取部分上清液進(jìn)行后續(xù)凈化，這樣可以避免過濾后濾渣洗滌是否完全的問題，所以實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好。

為了有效地提取雞肉組織中的二氯二甲吡啶酚殘留，分別采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等不同有機(jī)溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丙酮與甲醇的提取回收率相當(dāng)，但丙酮提取液中脂肪等雜質(zhì)的含量相對(duì)較高;乙酸乙酯和二氯甲烷則難以從未除去水的雞肉組織中提取目標(biāo)物，回收率低。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 凈化方法的選擇

在實(shí)驗(yàn)中還對(duì)市售氧化鋁固相萃取(SPE)小柱的凈化效果進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明這些小柱都不能很好地除去脂肪等雜質(zhì)。為此，采用自裝填氧化鋁層析柱凈化提取試液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化鋁層為5g和10g的層析柱回收率較低，15 g和20 g的層析柱回收率高，且二者差異不明顯，洗脫液也相對(duì)干凈。比較分析，最終選擇氧化鋁層的填充質(zhì)量為16 g。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

通過對(duì)二氯二甲吡啶酚丙酯全掃描后獲得EI質(zhì)譜圖(見圖1)，其特征碎片離子歸屬：m/z247為分子離子，m/z191為二氯二甲吡啶酚分子。選擇二氯二甲吡啶酚分子m/z191作為母離子，以一定的能量碰撞后獲得相應(yīng)的質(zhì)譜圖(圖2)，其特征碎片離子歸屬：m/z156為母離子失去一個(gè)Cl離子后的產(chǎn)物，m/z128為其進(jìn)開環(huán)后一步失去乙烯分子后的產(chǎn)物。為此，選擇m/z156及m/z128為子離子，與母離子形成兩個(gè)子離子對(duì)，用不同的能量對(duì)二氯二甲吡啶酚進(jìn)行MRM掃描后，發(fā)現(xiàn)碰撞能量為15 eV時(shí)，響應(yīng)值最高，故以此條件采用MRM模式對(duì)二氯二甲吡啶酚進(jìn)行定性和定量分析。

圖1 二氯二甲吡啶酚丙酯的全掃描質(zhì)譜圖

圖2 二氯二甲吡啶酚丙酯的子離子掃描質(zhì)譜圖(20 eV)

3.4 色譜條件

選擇起始溫度50℃，并采用每分鐘20℃的升溫速率時(shí)得到的峰形狀較好。

3.5 線性范圍

二氯二甲吡啶酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度在20 μg/L－240 μg/L內(nèi)，濃度與響應(yīng)值呈線性關(guān)系，線性回歸方程y=1.132x －2.553，相關(guān)系數(shù)大于0.998。

3.6 回收率、精密度和檢測(cè)限(LOQ)

以不含二氯二甲吡啶酚的雞肉和雞肝為檢測(cè)樣品，采用外加法在樣品中分別添加3個(gè)不同濃度水平的二氯二甲吡啶酚，作回收率和精密度試驗(yàn)，見表1;其標(biāo)準(zhǔn)溶液(120ng/mL)及雞肉中 5.0 μg/kg添加水平的樣品溶液圖譜見圖3、圖4;LOQ：雞肉中為5.0μg/kg，雞肝中為10.0μg/kg。

表1 雞肉中二氯二甲吡啶酚測(cè)定的回收率、精密度

圖3 二氯二甲吡啶酚標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖(120ng/mL)

圖4 雞肉中添加5 μg/kg二氯二甲吡啶酚的MRM色譜圖

4 結(jié)論

本方法選擇適宜的前處理，優(yōu)化了最佳儀器條件。結(jié)果表明，方法提取率高，檢測(cè)效果靈敏且穩(wěn)定，選擇性好，能滿足檢測(cè)要求，適合禽肉中二氯二甲吡啶酚殘留量的測(cè)定。

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